Biomarkörer och sjukdomsaktivitet hos patienter som behandlas med Teriflunomide (Aubagio)

TITEL: Förening av möjliga biomarkörer med sjukdomsaktivitet hos patienter som behandlas med teriflunomid (Aubagio ®)

A. BAKGRUND Teriflunomide (Aubagio) är en oral immunmodulerande DMT en gång dagligen för patienter med skovvis-remitterande MS (RRMS) (1). Syftet med föreliggande studie är att fastställa om en förmodad biomarkörsignatur förutsäger sjukdomsaktivitet hos patienter som behandlas med teriflunomid. Utredarna har tidigare identifierat en 130-genersignatur associerad med immunaktivering som identifierade patienter med MS som hade snabb övergång till sekundär progressiv MS (SPMS). Från denna signatur identifierade utredarna tre gener (TLR2, TLR4 och CCR1) som hade ökat proteinuttryck på naiva CD4 T-celler hos dessa patienter. Utredarna visade också att mRNA för en antiproliferationsfaktor, benämnd TOB1, var nedreglerad i dessa T-celler hos patienter med snabb MS-progression. Resultaten tyder därför på att naiv CD4 T-cellsaktivering identifierar patienter med MS som har en kort RRMS-varaktighet (2).

För detta förslag föreslår huvudutredaren att olika molekyler involverade i T-cellsaktivering också kan fungera som användbara biomarkörer för att förutsäga behandlingssvar på teriflunomid.

B. STUDIENS MÅL

B1. Studiemål och specifika mål. Målet är att avgöra om de T-cellsaktiveringsmarkörer som tidigare identifierats kommer att förutsäga sjukdomsaktivitet hos patienter som behandlas med teriflunomid.

De specifika studiens mål är att fastställa:

1. andelen patienter förbehandling (pre-Tx) som har förändrat uttryck av en eller flera kandidatmarkörer i en eller flera T-undergrupper;
2. huruvida uttrycksnivåer av en eller flera av dessa markörer i en T-undergrupp ändras vid behandling (On-Tx) med teriflunomid;
3. om skillnader i mRNA eller proteinkinetiken för en förmodad markör förutsäger sjukdomsaktivitet hos patienter som behandlas med teriflunomid;
4. huruvida uttrycksnivåer av en eller flera målmolekyler, Pre-Tx eller On-Tx, korrelerar med tecken på sjukdomsaktivitet efter ett års behandling.

C. STUDIEDESIGN.

C1. Designsammanfattning. Studien är en tvåårig prospektiv observationsstudie av patienter som behandlats med teriflunomid. Utredarna kommer att rekrytera upp till 75 patienter vid baslinjen. Utredarna kommer att studera patienter vid baslinjen och vid intervall On-Tx med teriflunomid för att identifiera patienter med aktiv kontra stabil sjukdom, baserat på kliniska (återfall) och radiologiska (nya T2 hyperintense lesioner) bevis. Utredarna kommer att studera uttrycket av biomarkörer i varje patientundergrupp.

C2. Primära slutpunkter. Studiens centrala fråga är om uttrycksnivåerna för en eller flera förmodade biomarkörer (TOB1, TLR2, TLR4, CCR1) skiljer sig(er) mellan patienter från de två informativa undergrupperna.

C3. Utfallsmått. Resultaten som kommer att behandla den centrala frågan i studien består av följande:

1. Mätningar av proteinuttrycksnivåer av TLR2, TLR4 och CCR1 på CD4 T-undergrupper genom flödescytometri.
2. TOB1-mRNA-uttryck i CD4 T-undergrupper genom kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) och PrimeFlow RNA-analysen.
3. Skillnader i mRNA eller proteinuttryck av utvalda markörer i korttidsodlingar mellan patienter från de två informativa undergrupperna.

C4. Ämnespopulation. Studiepopulationen inkluderar:

1. behandlingsnaiva patienter med RRMS från Montreal Neurological Hospital (MNH) MS-kliniker före behandling (pre-Tx) med teriflunomid; och
2. patienter med RRMS som tidigare behandlats med andra sjukdomsmodifierande terapier (DMT) men som byter till teriflunomid.

C5. Etikgodkännande: Studien godkändes av Neurosciences Research Ethics Board vid MNH/MN. Uppgifterna kommer att sparas i 7 år.

C6. samtycker. Huvudutredaren eller dennes ombud kommer att erhålla informerat samtycke

D. STUDIEPROCEDURER. Studien kommer att undersöka en biomarkörsignatur hos patienter med MS som behandlas med teriflunomid av sin neurolog.

D1. Deltagare och klinikbesök. Innan behandling med teriflunomid påbörjas kommer varje patient att ha en klinisk utvärdering, en MRT, som en del av rutinmässig klinisk praxis, och en blodtagning (se nedan). Med jämna mellanrum kommer deltagarna att ha en klinisk utvärdering och en andra MRT-utvärdering för att avgöra om de har aktiv eller stabil sjukdom. För att möjliggöra ett stegvis tillvägagångssätt kommer neurologerna att sträva efter att identifiera patienter efter sex månaders behandling som visar tecken på aktiv kontra stabil sjukdom, cirka 3 i varje undergrupp. Blodtagningar kommer att tas från var och en av dessa patienter för efterföljande laboratoriestudier (se nedan).

D2. Provsamling. Upp till 120 ml perifert venöst blod kommer att tas från varje patient vid baslinjen och med intervall, för att samla in serum och plasma, för att erhålla totala lymfocytantal, CD3, CD4 och CD8-räkningar och för att isolera perifera mononukleära celler från perifert blod (PBMC) för omedelbar analys och även för kryokonservering.

D3. Laboratorieanalys.

D3.1. Naiv CD4 T-cellsisolering och kvantitativ RT-PCR-analys av TOB1-uttryck. Minskat uttryck av TOB1, en hämmare av T-cellsproliferation, korrelerade med snabb progression från CIS till RRMS i en studie (2), och korrelerade även i utredarnas tidigare studie med snabb progression från RRMS till SPMS (2). Utredarna kommer att isolera naiva CD4 T-celler med hjälp av MACS-kulor (2) och bestämma TOB1-uttryck genom kvantitativ RT-PCR i en liten kohort av patienter (5-10 patienter) och åldersmatchade friska kontroller (HCs).

D3.2. Analys av kryokonserverad PBMC.

Strategi 1. Ytproteinuttryck av TLR2, TLR4 och CCR1 i CD4 T-undergrupper. Utredarna kommer att analysera baslinje- och On-Tx-kryokonserverade prover för uttryck (% positivitet och MFI) av TLR2, TLR4 och CCR1 på naivt, centralt minne, effektorminne, terminalt differentierat effektorminne och regulatoriska T-celler genom flödescytometri på en BD LSRFortessa med ett 5-lasersystem. Utredarna kommer att använda FlowJo programvara för analys. Utredarna kommer att identifiera den biomarkör som är mest informativ, dvs. visar den största skillnaden i uttrycksnivåer mellan patienter i de två informativa undergrupperna vid baslinjen eller vid behandling.

Strategi 2. Jämförelse av TOB1-mRNA-uttryck med qRT-PCR och PrimeFlow RNA-analysen. Utredarna kommer att utveckla PrimeFlow™ RNA-analysen (affymetrix Ebioscience) för samtidig analys av mRNA och proteinuttryck. Inledningsvis kommer utredarna att jämföra TOB1-mRNA-uttryck med det som erhålls med qRT-PCR, eftersom qRT-PCR är guldstandarden för mRNA-kvantifiering. Utredarna kommer att jämföra TOB1-mRNA-uttryck i naiva CD4 T-celler med de två metoderna. Om mätningarna är jämförbara kommer utredarna att samtidigt kunna bedöma TOB1-uttryck i naiva CD4 T-celler och uttrycket av den mest informativa biomarkören i CD4 T-undergrupper och jämföra uttrycksnivåer hos patienter från de två informativa subgrupperna enligt nedan .

Strategi 3. mRNA och proteinkinetik för TOB1 och en T-cellsbiomarkör i stimulerade T-celler. Utredarna förväntar sig att T-cellsstimulering kommer att identifiera skillnader mellan patienter från de två informativa undergrupperna i antingen mRNA eller proteinkinetik för TOB1 eller en av våra ytproteinbiomarkörer. Med andra ord kan dessa studier visa skillnader mellan patienter med aktiv kontra stabil MS.

Denna strategi innefattar en stimuleringsfas och en analytisk fas enligt följande.

1. För det första, efter att ha valt patienter från de två patientundergrupperna (3-4 patienter/undergrupp) och från åldersmatchade HC:er, kommer utredarna att stimulera kryokonserverad PBMC från baslinje- och ettårsbehandlingsprover med PMA/ionomycin och BD GolgiStop™ Protein Transport-hämmare under 4 timmar vid 37°C i 5 % CO2. Utredarna kommer att bestämma de optimala koncentrationerna av varje reagens genom analysspecifik titrering för användning med PrimeFlow RNA-analysen.
2. Den andra fasen kommer att använda PrimeFlow RNA-analysen för att bedöma mRNA- och proteinkinetiken för TOB1 och den mest informativa ytproteinbiomarkören i patientundergrupper och HC:er. Denna analys kan avslöja dynamiken i både RNA- och proteinuttryck i individuella celler och i T-undergrupper som svar på T-cellstimulering. Användbarheten av PrimeFlow RNA-analysen validerades i en landmärkestudie av T-undergrupper (4); detaljerade metoder finns tillgängliga på följande webbplats: http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf.

D4. Statistisk analys. Utredarna kommer att använda GraphPad Prism 7 för alla statistiska analyser och använda lämpliga parametriska eller icke-parametriska tester enligt datafördelningen.

E. FÖRVÄNTADE RESULTAT. För det första förutser utredarna att en eller flera T-undergrupper i PBMC-prover vid baslinje (före teriflunomidbehandling) kommer att visa ökat ytproteinuttryck av en eller flera T-cellsaktiveringsmolekyler hos patienter som visar sjukdomsaktivitet On-Tx jämfört med patienter som visar inte sjukdomsaktivitet On-Tx. Ett sådant fynd kan hjälpa till att identifiera patienter för vilka teriflunomid är den optimala DMT. För det andra kan behandling med teriflunomid förändra uttrycket av en eller flera T-cellsaktiveringsmolekyler i en eller flera T-undergrupper och denna förändring kan korrelera med minskad sjukdomsaktivitet, vilket tyder på att förändrad T-cellsaktivering bidrar till ett positivt svar på teriflunomid . För det tredje kan korttidsodlingar av baslinjeprover kontra ettårsprover från patienter och från åldersmatchade HC:er identifiera skillnader i mRNA och proteinkinetik för en T-cellsaktiveringsmarkör hos patienter vid baslinjen, som sedan återgår till ett normalt mönster i de utan sjukdomsaktivitet efter ett år. Sådana fynd skulle peka på viktiga funktionella förändringar medierade av teriflunomid som korrelerar med ett positivt terapeutiskt svar.

F. STUDIEPLATSER Alla patienter kommer att rekryteras från Montreal Neurological Hospital MS Clinics och allt experimentellt arbete kommer att utföras i Duff Medical Building, Department of Pathology, McGill University.

G. TIDSLINJER G.1. First Patient In (FPI) - en månad efter kontraktets genomförande och etikgodkännande.

G.2. Last Patient In (LPI) ~ 12-15 månader efter genomförandet av kontraktet och etiskt godkännande: detta återspeglar den tid som krävs för att rekrytera totalt upp till 75 patienter som behandlas med Teriflunomide.

G.3. Interimsanalyser

• Bedöm rekryteringsgraden efter 2 månader för att överväga att inkludera satellitcenter.
• RT-PCR-analys av TOB1 hos 5-10 patienter Pre-TX och åldersmatchade HC (4 månader).
• Preliminär flödescytometrianalys av ytproteinbiomarkörer baserad på preliminär identifiering av ~ 3 aktiva kontra ~ 3 stabila patienter identifierade vid 8 månaders On-Tx tidpunkt
• Ytterligare flödescytometrianalys av ytproteinbiomarkörer på ytterligare 3 aktiva kontra 3 stabila patienter identifierade vid 14-månaders On-Tx-tidpunkten.

G4. Lägesrapporter. Kvartalsvisa framstegsuppdateringar om patientrekrytering och halvårsrapport om kliniska utvärderingsparametrar till undergruppspatienter.

G5. Senaste patientbesök (LPLV) - 24-27 månader. G6. Slutförande av slutrapport - 30 månader. G7. Planerad manuskriptinlämning. 33 månader. H. BILAGOR BILAGA 1. Primär antikroppspanel

1. FVS 510 (BD)
2. CD4 BUV395 (BD)
3. CD45RA BV421 (BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786 (BD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (FoU-system)
7. TLR2 PE (eBioscience)
8. CCR7 PE-CF594 (BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (eBioscience)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizon™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizon™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (Molecular Probes) (ibland förkortad. AF) PE-CF594: BD Horizon™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ BILAGA 2. PrimeFlow™ RNA-analyspaneler inklusive TLR2 som en möjlig biomarkör - under utveckling