テリフルノミドで治療された患者におけるバイオマーカーと疾患活動性 (Aubagio)

タイトル: テリフルノミド (Aubagio ®) で治療された患者における疾患活動性と考えられるバイオマーカーの関連性

A. 背景 テリフルノミド (Aubagio) は、再発寛解型 MS (RRMS) 患者向けの 1 日 1 回経口免疫調節 DMT です (1)。 本研究の目的は、推定上のバイオマーカーのサインがテリフルノミドで治療された患者の疾患活動性を予測するかどうかを判断することです。 研究者らは以前、二次進行性MS（SPMS）に急速に移行したMS患者を特定する免疫活性化に関連する130の遺伝子サインを特定した。 このサインから、研究者らは、これらの患者のナイーブ CD4 T 細胞でタンパク質発現を増加させる 3 つの遺伝子 (TLR2、TLR4、および CCR1) を特定しました。 研究者らはまた、急速なMS進行を示す患者では、TOB1と呼ばれる抗増殖因子のmRNAがこれらのT細胞で下方制御されていることも示した。 したがって、この発見は、ナイーブ CD4 T 細胞の活性化により、RRMS 持続期間が短い MS 患者を識別することを示唆しています (2)。

この提案に関して、主任研究者は、T 細胞の活性化に関与するさまざまな分子が、テリフルノミドに対する治療反応を予測するための有用なバイオマーカーとしても機能する可能性があることを示唆しています。

B. 研究の目的

B1.研究の目的と具体的な目的。 目的は、以前に同定された T 細胞活性化マーカーがテリフルノミドで治療された患者の疾患活動性を予測するかどうかを判断することです。

具体的な研究の目的は、以下を決定することです。

1. 1つまたは複数のTサブセットにおける1つまたは複数の候補マーカーの発現が変化した治療前(pre-Tx)の患者の割合。
2. T サブセットにおけるこれらのマーカーの 1 つ以上の発現レベルがテリフルノミドによる治療 (On-Tx) で変化するかどうか。
3. 推定上のマーカーのmRNAまたはタンパク質動態の違いが、テリフルノミドで治療された患者の疾患活動性を予測するかどうか。
4. 1 つ以上の標的分子、Pre-Tx または On-Tx の発現レベルが、1 年間の治療後の疾患活動性の証拠と相関するかどうか。

C. 研究デザイン。

C1.デザインの概要。 この研究は、テリフルノミドで治療された患者を対象とした2年間の前向き観察研究です。 研究者はベースライン時に最大 75 人の患者を募集します。 研究者らは、臨床的（再発）および放射線学的（新たなT2高信号病変）の証拠に基づいて、活動性疾患と安定疾患を有する患者を特定するために、ベースライン時および一定間隔でテリフルノミドを投与する患者を研究する予定である。 研究者らは、各患者サブグループにおけるバイオマーカーの発現を研究する予定です。

C2. 主要エンドポイント。 この研究の中心的な疑問は、1 つ以上の推定バイオマーカー (TOB1、TLR2、TLR4、CCR1) の発現レベルが 2 つの有益なサブグループの患者間で異なるかどうかです。

C3.成果対策。 研究の中心的な問題に対処する成果は次のとおりです。

1. フローサイトメトリーによる、CD4 T サブセット上の TLR2、TLR4、および CCR1 のタンパク質発現レベルの測定。
2. 定量的 RT-PCR (qRT-PCR) および PrimeFlow RNA アッセイによる CD4 T サブセットにおける TOB1 mRNA 発現。
3. 2 つの有益なサブグループの患者間の、短期培養における選択されたマーカーの mRNA またはタンパク質発現の差異。

C4.対象人口。 研究対象集団には次のものが含まれます。

1. テリフルノミドによる治療前（Tx前）のモントリオール神経病院（MNH）MSクリニックの未治療のRRMS患者。と
2. 以前は他の疾患修飾療法（DMT）で治療されていたが、テリフルノミドに切り替えようとしているRRMS患者。

C5.倫理承認: この研究は、MNH/MN の神経科学研究倫理委員会によって承認されました。 データは7年間保存されます。

C6.同意。 研究主任者またはその代理人はインフォームドコンセントを取得します。

D. 研究手順。 この研究では、神経内科医によってテリフルノミドによる治療を受けているMS患者のバイオマーカーの特徴を調査する予定です。

D1.参加者とクリニックの訪問。 テリフルノミドによる治療を開始する前に、各患者は日常臨床診療の一環として臨床評価、MRI、および採血を受けます (下記を参照)。 参加者は一定の間隔で臨床評価と2回目のMRI評価を受け、活動性疾患か安定疾患かを判断します。 段階的なアプローチを可能にするために、神経内科医は、6 か月の治療後に活動性疾患と安定性疾患の証拠を示す患者を、各サブグループに約 3 名ずつ特定するよう努めます。 その後の臨床検査のために、これらの患者のそれぞれから採血が行われます（以下を参照）。

D2.サンプルコレクション。 血清と血漿を収集し、総リンパ球数、CD3、CD4、および CD8 数を取得し、末梢血単核球 (PBMC) を即時分離するために、ベースラインおよび間隔をおいて各被験者から最大 120 ml の末梢静脈血が採取されます。分析や冷凍保存にも使用できます。

D3.実験室分析。

D3.1. ナイーブ CD4 T 細胞の単離と TOB1 発現の定量的 RT-PCR 分析。 T細胞増殖の阻害剤であるTOB1の発現低下は、ある研究ではCISからRRMSへの急速な進行と相関しており(2)、研究者らの以前の研究でもRRMSからSPMSへの急速な進行と相関していた(2)。 研究者らは、MACS ビーズ (2) を使用してナイーブ CD4 T 細胞を単離し、患者の小規模コホート (5 ～ 10 人の患者) および年齢を一致させた健康な対照 (HC) における定量的 RT-PCR によって TOB1 発現を測定します。

D3.2. 凍結保存された PBMC の分析。

戦略 1. CD4 T サブセットにおける TLR2、TLR4、および CCR1 の表面タンパク質発現。 研究者らは、BD LSRFortessa 上のフローサイトメトリーにより、ベースラインおよび On-Tx 凍結保存サンプルを分析して、ナイーブ細胞、中枢記憶細胞、エフェクター記憶細胞、最終分化エフェクター記憶細胞および制御性 T 細胞における TLR2、TLR4、および CCR1 の発現 (陽性率および MFI) を分析します。 5レーザーシステム搭載。 調査員は分析に FlowJo ソフトウェアを使用します。 研究者らは、最も有益なバイオマーカー、つまり、ベースライン時または治療時の 2 つの有益なサブグループの患者間の発現レベルの最大の違いを示すバイオマーカーを特定します。

戦略 2. qRT-PCR と PrimeFlow RNA アッセイによる TOB1 mRNA 発現の比較。 研究者らは、mRNA とタンパク質の発現を同時に分析するための PrimeFlow™ RNA アッセイ (affymetrix Ebioscience) を開発する予定です。 qRT-PCR は mRNA 定量化のゴールドスタンダードであるため、研究者らはまず、TOB1 mRNA 発現と qRT-PCR によって得られた発現を比較します。 研究者らは、ナイーブ CD4 T 細胞における TOB1 mRNA 発現を 2 つの方法で比較する予定です。 測定値が同等であれば、研究者は、ナイーブ CD4 T 細胞における TOB1 発現と CD4 T サブセットにおける最も有益なバイオマーカーの発現を同時に評価し、以下に概説する 2 つの有益なサブグループの患者における発現レベルを比較することができます。 。

戦略 3. TOB1 の mRNA およびタンパク質の動態、および刺激された T 細胞における T 細胞バイオマーカー。 研究者らは、T 細胞刺激により、TOB1 の mRNA またはタンパク質動態、または当社の表面タンパク質バイオマーカーのいずれかにおける 2 つの有益なサブグループの患者間の差異が特定されると予想しています。 言い換えれば、これらの研究は、活動性MS患者と安定型MS患者の間の違いを示している可能性があります。

この戦略には、次のような刺激フェーズと分析フェーズが含まれます。

1. まず、2 つの患者サブグループ (サブグループあたり 3 ～ 4 人の患者) および年齢が一致する HC から患者を選択した後、研究者は、PMA/イオノマイシンおよび BD GolgiStop™ タンパク質輸送阻害剤を使用して、ベースラインおよび 1 年間の治療サンプルから凍結保存された PBMC を刺激します。 5% CO2、37℃で 4 時間。 研究者は、PrimeFlow RNA アッセイで使用するための、アッセイ固有の滴定を通じて各試薬の最適濃度を決定します。
2. 第 2 フェーズでは、PrimeFlow RNA アッセイを使用して、TOB1 の mRNA およびタンパク質動態、および患者サブグループおよび HC における最も有益な表面タンパク質バイオマーカーを評価します。 このアッセイは、T 細胞刺激に応答した個々の細胞および T サブセットにおける RNA とタンパク質の両方の発現の動態を明らかにすることができます。 PrimeFlow RNA アッセイの有用性は、T サブセットの画期的な研究で検証されました (4)。詳細な方法は、Web サイト http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf で入手できます。

D4.統計分析。 研究者はすべての統計分析に GraphPad Prism 7 を使用し、データ分布に応じて適切なパラメトリックまたはノンパラメトリック テストを使用します。

E. 予想される結果。 まず、研究者らは、ベースライン PBMC サンプル (テリフルノミド治療前) 中の 1 つ以上の T サブセットが、Tx で疾患活動性を示す患者と、Tx で疾患活動性を示す患者において 1 つ以上の T 細胞活性化分子の表面タンパク質発現の増加を示すと予想しています。 Tx 上で疾患活動性を示さない。 このような発見は、テリフルノミドが最適な DMT である患者を特定するのに役立つ可能性があります。 第二に、テリフルノミドによる治療は、1つまたは複数のTサブセットにおける1つまたは複数のT細胞活性化分子の発現を変化させる可能性があり、この変化は疾患活動性の低下と相関する可能性があり、それによってT細胞活性化の変化がテリフルノミドに対する陽性反応に寄与することが示唆されます。 。 第三に、ベースラインサンプルと患者および年齢が一致するHCからの1年間のサンプルの短期培養により、ベースライン時の患者のT細胞活性化マーカーのmRNAおよびタンパク質動態の違いが特定され、その後正常なパターンに戻る可能性があります。 1年間で病気の活動性がない人。 このような発見は、陽性の治療反応と相関する、テリフルノミドによって媒介される重要な機能変化を指摘するであろう。

F. 研究施設 すべての患者はモントリオール神経病院 MS クリニックから集められ、すべての実験作業はマギル大学病理学部のダフ医療棟で行われます。

G. タイムライン G.1. First Patient In (FPI) - 契約の締結と倫理承認の 1 か月後。

G.2. 最終患者入力期間 (LPI) ~ 契約締結および倫理承認後 12 ～ 15 か月: これは、テリフルノミドで治療される合計最大 75 人の患者を募集するのに必要な時間を反映しています。

G.3.中間分析

• 2 か月後の採用率を評価し、サテライト センターの導入を検討します。
• 5～10人のPre-TX患者および年齢が一致したHC（4か月）におけるTOB1のRT-PCR分析。
• 8 か月の On-Tx 時点で特定された、活動的な患者 ～ 3 名と安定した患者 ～ 3 名の暫定的な同定に基づく、表面タンパク質バイオマーカーの予備的なフローサイトメトリー分析
• 14 か月の On-Tx 時点で特定された、さらに 3 人の活動的な患者と 3 人の安定した患者の表面タンパク質バイオマーカーの追加のフローサイトメトリー分析。

G4。進捗報告。 患者募集に関する四半期ごとの進捗状況の最新情報と、サブグループ患者に対する臨床評価パラメーターに関する半年ごとのレポート。

G5。 最終患者訪問 (LPLV) - 24 ～ 27 か月。 G6。 最終報告書の完成 - 30 か月。 G7。 予定されている原稿の提出。 33ヶ月。 H. 付録 付録 1. 一次抗体パネル

1. FVS510(BD)
2. CD4 BUV395 (BD)
3. CD45RA BV421(BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786(BD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (R&D システム)
7. TLR2 PE (eバイオサイエンス)
8. CCR7 PE-CF594(BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (eバイオサイエンス)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizo​​n™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizo​​n™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizo​​n™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (分子プローブ) (場合によっては略語) AF) PE-CF594: BD Horizo​​n™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ 付録 2. バイオマーカー候補として TLR2 を含む PrimeFlow™ RNA アッセイパネル - 開発中