Biomarker und Krankheitsaktivität bei mit Teriflunomid (Aubagio) behandelten Patienten

TITEL: Zusammenhang möglicher Biomarker mit der Krankheitsaktivität bei mit Teriflunomid (Aubagio ®) behandelten Patienten

A. HINTERGRUND Teriflunomid (Aubagio) ist ein einmal täglich oral einzunehmendes immunmodulatorisches DMT für Patienten mit schubförmig remittierender MS (RRMS) (1). Das Ziel der vorliegenden Studie besteht darin, festzustellen, ob eine mutmaßliche Biomarker-Signatur die Krankheitsaktivität bei mit Teriflunomid behandelten Patienten vorhersagt. Die Forscher identifizierten zuvor eine 130-Gen-Signatur im Zusammenhang mit der Immunaktivierung, die Patienten mit MS identifizierte, die einen schnellen Übergang zu sekundär progredienter MS (SPMS) hatten. Anhand dieser Signatur identifizierten die Forscher drei Gene (TLR2, TLR4 und CCR1), die bei diesen Patienten eine erhöhte Proteinexpression auf naiven CD4-T-Zellen aufwiesen. Die Forscher zeigten auch, dass die mRNA für einen Anti-Proliferationsfaktor namens TOB1 in diesen T-Zellen bei Patienten mit schnellem Fortschreiten der MS herunterreguliert war. Die Ergebnisse legen daher nahe, dass die naive CD4-T-Zellaktivierung Patienten mit MS identifiziert, die eine kurze RRMS-Dauer aufweisen (2).

Für diesen Vorschlag schlägt der Hauptforscher vor, dass verschiedene Moleküle, die an der T-Zell-Aktivierung beteiligt sind, auch als nützliche Biomarker zur Vorhersage von Behandlungsreaktionen auf Teriflunomid dienen könnten.

B. STUDIENZIELE

B1. Studienziel und spezifische Ziele. Ziel ist es festzustellen, ob die zuvor identifizierten T-Zell-Aktivierungsmarker die Krankheitsaktivität bei mit Teriflunomid behandelten Patienten vorhersagen können.

Die konkreten Studienziele bestehen darin, Folgendes zu ermitteln:

1. der Anteil der Patienten vor der Behandlung (vor Tx), die eine veränderte Expression eines oder mehrerer Kandidatenmarker in einer oder mehreren T-Untergruppen aufweisen;
2. ob sich die Expressionsniveaus eines oder mehrerer dieser Marker in einer T-Untergruppe unter der Behandlung (On-Tx) mit Teriflunomid ändern;
3. ob Unterschiede in der mRNA- oder Proteinkinetik eines mutmaßlichen Markers die Krankheitsaktivität bei mit Teriflunomid behandelten Patienten vorhersagen;
4. ob die Expressionsniveaus eines oder mehrerer Zielmoleküle, Pre-Tx oder On-Tx, mit dem Nachweis einer Krankheitsaktivität nach einem Jahr Behandlung korrelieren.

C. STUDIENDESIGN.

C1. Zusammenfassung des Entwurfs. Bei der Studie handelt es sich um eine zweijährige prospektive Beobachtungsstudie an mit Teriflunomid behandelten Patienten. Die Forscher werden zu Studienbeginn bis zu 75 Patienten rekrutieren. Die Forscher werden Patienten zu Studienbeginn und in Intervallen unter Tx mit Teriflunomid untersuchen, um Patienten mit aktiver vs. stabiler Erkrankung zu identifizieren, basierend auf klinischen (Rückfall) und radiologischen (neue hyperintensive T2-Läsionen) Beweisen. Die Forscher werden die Expression von Biomarkern in jeder Patientenuntergruppe untersuchen.

C2. Primäre Endpunkte. Die zentrale Frage der Studie ist, ob sich die Expressionsniveaus eines oder mehrerer mutmaßlicher Biomarker (TOB1, TLR2, TLR4, CCR1) zwischen Patienten aus den beiden informativen Untergruppen unterscheiden.

C3. Zielparameter. Die Ergebnisse, die sich mit der zentralen Frage der Studie befassen, sind die folgenden:

1. Messungen der Proteinexpressionsniveaus von TLR2, TLR4 und CCR1 auf CD4-T-Untergruppen mittels Durchflusszytometrie.
2. TOB1-mRNA-Expression in CD4-T-Untergruppen durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR) und den PrimeFlow RNA-Assay.
3. Unterschiede in der mRNA- oder Proteinexpression ausgewählter Marker in Kurzzeitkulturen zwischen Patienten aus den beiden informativen Untergruppen.

C4. Subjektpopulation. Die Studienpopulation umfasst:

1. therapienaive Patienten mit RRMS aus den MS-Kliniken des Montreal Neurological Hospital (MNH) vor der Behandlung (prä-Tx) mit Teriflunomid; Und
2. Patienten mit RRMS, die zuvor mit anderen krankheitsmodifizierenden Therapien (DMTs) behandelt wurden, aber auf Teriflunomid umsteigen.

C5. Ethische Genehmigung: Die Studie wurde vom Neurosciences Research Ethics Board des MNH/MN genehmigt. Die Daten werden 7 Jahre lang aufbewahrt.

C6. Einwilligungen. Der Hauptermittler oder sein Stellvertreter holen eine Einverständniserklärung ein

D. STUDIENVERFAHREN. Die Studie wird eine Biomarker-Signatur bei Patienten mit MS untersuchen, die von ihrem Neurologen mit Teriflunomid behandelt werden.

D1. Teilnehmer und Klinikbesuche. Vor Beginn der Behandlung mit Teriflunomid wird jeder Patient einer klinischen Untersuchung, einem MRT im Rahmen der klinischen Routinepraxis und einer Blutabnahme unterzogen (siehe unten). In regelmäßigen Abständen werden die Teilnehmer einer klinischen Untersuchung und einer zweiten MRT-Untersuchung unterzogen, um festzustellen, ob bei ihnen eine aktive oder eine stabile Erkrankung vorliegt. Um einen stufenweisen Ansatz zu ermöglichen, werden sich die Neurologen bemühen, nach sechsmonatiger Behandlung Patienten zu identifizieren, die Hinweise auf eine aktive vs. stabile Erkrankung zeigen, etwa drei in jeder Untergruppe. Von jedem dieser Patienten werden Blutabnahmen für nachfolgende Laboruntersuchungen durchgeführt (siehe unten).

D2. Beispielsammlung. Bis zu 120 ml peripheres venöses Blut werden jedem Probanden zu Studienbeginn und in regelmäßigen Abständen entnommen, um Serum und Plasma zu sammeln, die Gesamtzahl der Lymphozyten, die CD3-, CD4- und CD8-Zahlen zu ermitteln und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) für den sofortigen Einsatz zu isolieren Analyse und auch zur Kryokonservierung.

D3. Laboranalyse.

D3.1. Naive CD4-T-Zell-Isolierung und quantitative RT-PCR-Analyse der TOB1-Expression. Eine verringerte Expression von TOB1, einem Inhibitor der T-Zell-Proliferation, korrelierte in einer Studie mit einem schnellen Fortschreiten von CIS zu RRMS (2) und korrelierte in der vorherigen Studie der Forscher auch mit einem schnellen Fortschreiten von RRMS zu SPMS (2). Die Forscher werden naive CD4-T-Zellen mithilfe von MACS-Perlen (2) isolieren und die TOB1-Expression durch quantitative RT-PCR in einer kleinen Kohorte von Patienten (5–10 Patienten) und altersentsprechenden gesunden Kontrollpersonen (HCs) bestimmen.

D3.2. Analyse kryokonservierter PBMC.

Strategie 1. Oberflächenproteinexpression von TLR2, TLR4 und CCR1 in CD4-T-Untergruppen. Die Forscher werden kryokonservierte Baseline- und On-Tx-Proben auf Expression (% Positivität und MFI) von TLR2, TLR4 und CCR1 auf naivem, zentralem Gedächtnis, Effektorgedächtnis, terminal differenziertem Effektorgedächtnis und regulatorischen T-Zellen durch Durchflusszytometrie auf einem BD LSRFortessa analysieren mit einem 5-Laser-System. Die Ermittler werden die FlowJo-Software zur Analyse verwenden. Die Forscher werden den Biomarker identifizieren, der am aussagekräftigsten ist, d. h. den größten Unterschied in den Expressionsniveaus zwischen Patienten in den beiden informativen Untergruppen zu Studienbeginn oder während der Behandlung aufweist.

Strategie 2. Vergleich der TOB1-mRNA-Expression durch qRT-PCR und den PrimeFlow RNA-Assay. Die Forscher werden den PrimeFlow™ RNA-Assay (affymetrix Ebioscience) zur gleichzeitigen Analyse der mRNA- und Proteinexpression entwickeln. Zunächst werden die Forscher die TOB1-mRNA-Expression mit der durch qRT-PCR erhaltenen vergleichen, da qRT-PCR der Goldstandard für die mRNA-Quantifizierung ist. Die Forscher werden die TOB1-mRNA-Expression in naiven CD4-T-Zellen anhand der beiden Methoden vergleichen. Wenn die Messungen vergleichbar sind, können die Forscher gleichzeitig die TOB1-Expression in naiven CD4-T-Zellen und die Expression des informativsten Biomarkers in CD4-T-Untergruppen beurteilen und die Expressionsniveaus bei Patienten aus den beiden informativen Untergruppen vergleichen, wie unten beschrieben .

Strategie 3. mRNA- und Proteinkinetik von TOB1 und einem T-Zell-Biomarker in stimulierten T-Zellen. Die Forscher gehen davon aus, dass die T-Zell-Stimulation Unterschiede zwischen Patienten aus den beiden informativen Untergruppen entweder in der mRNA- oder Proteinkinetik von TOB1 oder einem unserer Oberflächenprotein-Biomarker identifizieren wird. Mit anderen Worten: Diese Studien können Unterschiede zwischen Patienten mit aktiver und stabiler MS zeigen.

Diese Strategie umfasst eine Stimulationsphase und eine Analysephase wie folgt.

1. Zunächst werden die Forscher nach der Auswahl von Patienten aus den beiden Patientenuntergruppen (3-4 Patienten/Untergruppe) und aus altersentsprechenden HCs kryokonservierte PBMC aus Basis- und einjährigen Behandlungsproben mit PMA/Ionomycin und BD GolgiStop™ Proteintransportinhibitor stimulieren für 4 Stunden bei 37° C in 5 % CO2. Die Forscher bestimmen die optimalen Konzentrationen jedes Reagenzes durch assayspezifische Titration zur Verwendung mit dem PrimeFlow RNA-Assay.
2. In der zweiten Phase wird der PrimeFlow RNA Assay verwendet, um die mRNA- und Proteinkinetik von TOB1 und dem aussagekräftigsten Oberflächenprotein-Biomarker in Patientenuntergruppen und HCs zu bewerten. Dieser Assay kann die Dynamik sowohl der RNA- als auch der Proteinexpression in einzelnen Zellen und in T-Untergruppen als Reaktion auf die T-Zell-Stimulation aufdecken. Der Nutzen des PrimeFlow-RNA-Assays wurde in einer bahnbrechenden Studie zu T-Untergruppen validiert (4); Detaillierte Methoden finden Sie auf der folgenden Website: http://www.ebioscience.com/media/newpdf/PrimeFlowRNAAssayUM010915.pdf.

D4. Statistische Analyse. Die Forscher verwenden GraphPad Prism 7 für alle statistischen Analysen und verwenden entsprechend der Datenverteilung geeignete parametrische oder nichtparametrische Tests.

E. ERWARTETE ERGEBNISSE. Erstens gehen die Forscher davon aus, dass eine oder mehrere T-Untergruppen in Basis-PBMC-Proben (vor der Behandlung mit Teriflunomid) eine erhöhte Oberflächenproteinexpression eines oder mehrerer T-Zell-Aktivierungsmoleküle bei den Patienten zeigen werden, die unter Tx eine Krankheitsaktivität zeigen, im Vergleich zu Patienten, die dies tun zeigen beim Senden keine Krankheitsaktivität. Ein solcher Befund kann dabei helfen, Patienten zu identifizieren, für die Teriflunomid die optimale DMT darstellt. Zweitens kann die Behandlung mit Teriflunomid die Expression eines oder mehrerer T-Zell-Aktivierungsmoleküle in einer oder mehreren T-Untergruppen verändern, und diese Veränderung kann mit einer verringerten Krankheitsaktivität korrelieren, was darauf hindeutet, dass eine veränderte T-Zell-Aktivierung zu einer positiven Reaktion auf Teriflunomid beiträgt . Drittens können Kurzzeitkulturen von Ausgangsproben im Vergleich zu Ein-Jahres-Proben von Patienten und von gleichaltrigen HCs Unterschiede in der mRNA- und Proteinkinetik eines T-Zell-Aktivierungsmarkers bei Patienten zu Studienbeginn identifizieren, die dann zu einem normalen Muster zurückkehren diejenigen ohne Krankheitsaktivität nach einem Jahr. Solche Ergebnisse würden auf wichtige funktionelle Veränderungen hinweisen, die durch Teriflunomid vermittelt werden und mit einer positiven therapeutischen Reaktion korrelieren.

F. STUDIENSTANDORTE Alle Patienten werden aus den MS-Kliniken des Montreal Neurological Hospital rekrutiert und alle experimentellen Arbeiten werden im Duff Medical Building der Abteilung für Pathologie der McGill University durchgeführt.

G. ZEITPLAN G.1. First Patient In (FPI) – einen Monat nach Vertragsabschluss und Ethikgenehmigung.

G.2. Letzter Patient in (LPI) ~ 12–15 Monate nach Vertragsabschluss und ethischer Genehmigung: Dies spiegelt die Zeit wider, die erforderlich ist, um insgesamt bis zu 75 mit Teriflunomid behandelte Patienten zu rekrutieren.

G.3. Zwischenanalysen

• Bewerten Sie die Rekrutierungsrate nach 2 Monaten, um die Einbeziehung von Satellitenzentren in Betracht zu ziehen.
• RT-PCR-Analyse von TOB1 bei 5–10 Patienten vor TX und altersentsprechenden HCs (4 Monate).
• Vorläufige durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenprotein-Biomarkern basierend auf der vorläufigen Identifizierung von ~ 3 aktiven vs. ~ 3 stabilen Patienten, die zum On-Tx-Zeitpunkt nach 8 Monaten identifiziert wurden
• Zusätzliche Durchflusszytometrie-Analyse von Oberflächenprotein-Biomarkern bei weiteren 3 aktiven vs. 3 stabilen Patienten, die zum 14-monatigen On-Tx-Zeitpunkt identifiziert wurden.

G4. Fortschrittsbericht. Vierteljährliche Fortschrittsaktualisierungen bei der Patientenrekrutierung und halbjährlicher Bericht über klinische Bewertungsparameter für Untergruppen von Patienten.

G5. Letzter Patientenbesuch (LPLV) – 24–27 Monate. G6. Fertigstellung des Abschlussberichts – 30 Monate. G7. Geplante Manuskripteinreichung. 33 Monate. H. ANHÄNGE ANHANG 1. Primäres Antikörper-Panel

1. FVS 510 (BD)
2. CD4 BUV395 (BD)
3. CD45RA BV421 (BD)
4. CD127 BUV737 (BD)
5. CD25 BV786 (BD)
6. CCR1 Alexa Fluor® 488 (F&E-System)
7. TLR2 PE (eBioscience)
8. CCR7 PE-CF594 (BD)
9. CD14 PerCP-Cy5.5 (BD)
10. TLR4 APC (eBioscience)
11. CD3 APC-H7 (BD) FVS 510: BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510 BUV: BD Horizon™ Brilliant Ultraviolet™ BV: BD Horizon™ Brilliant Violet™ Alexa Fluor® (Molecular Probes) (manchmal abgekürzt. AF) PE-CF594: BD Horizon™ PE-CF594 APC-H7: BD Pharmingen™ ANHANG 2. PrimeFlow™ RNA-Assay-Panels einschließlich TLR2 als möglicher Biomarker – in Entwicklung