Kohti Parkinsonin taudin molekyyliprofilointia helposti saatavilla olevissa biologisissa matriiseissa

Yhteenveto Parkinsonin tauti (PD) on yleisin neurodegenaratiivinen sairaus, johon liittyy vammauttavia motorisia puutteita. PD on kliinisesti heterogeeninen, joten erilaisia patofysiologisia näkökohtia heijastavia biomarkkereita tarvitaan potilaiden luokitteluun ja valintaan kliinisissä tutkimuksissa. Tässä hankkeessa tavoitteemme on mitata erilaisiin molekyylitiet reitteihin (esim. synukleinopatia, neurotulehdus, neurodegeneraatio, amyloidoosi ja tauopatia) liittyviä biomarkkereita erilaisissa biologisissa näytteissä (selkäydinneste, plasma, hajuelimen limakalvo ja iho), jotka on kerätty hyvin karakterisoiduilta PD-potilailta, muiden neurologisten/neurodegeneratiivisten sairauksien potilailta ja verrokkiryhmiltä. Tarkasteltavien näytteiden joukossa hajuelimen limakalvo ja plasma ovat helposti saatavilla ja siksi sopivia toistettavaan näytteenottoon kliinisissä tutkimuksissa. Erilaisia biomarkkereita yhdistetään motorisiin, neuropsykologisiin ja funktionaalisiin pisteytyksiin ymmärtääkseen niiden kykyä ennustaa erilaisia kliinisia tuloksia.

Tausta / Nykyinen tila Parkinsonin tauti (PD) on synukleinopatia ja yleisin neurodegenaratiivinen sairaus, johon liittyy vammauttavia motorisia puutteita. PD on kliinisesti heterogeeninen; motorisia oireita saattaa seurata ei-motorisia oireita kuten kognitiivisia heikkouksia. Monet molekyyliprosessit saattavat olla PD:n fenotyyppisen heterogeenisyyden taustalla, joista synapsien ja aksonien degeneraatio, neurotulehdus sekä erilaisten proteiinopatioiden yhteisilmaantuvuus ovat parhaiten karakterisoituja ja niillä, joilla on paras mahdollisuus luotettavasti heijastua nykyisin olemassa olevilla biomarkkereilla. Itse asiassa robustien biomarkkereiden määrittely, jotka heijastavat PD:ssä tapahtuvia erillisiä patofysiologisia reittejä, saattaa edesauttaa homogeenisempien potilasryhmien valintaa kliinisissä tutkimuksissa, mikä lisää sairautta muokkaavan terapian onnistumismahdollisuuksia, joka vaikuttaa yhteen tai useampaan näistä reiteistä. Lisäksi näiden markkereiden mittaaminen biologisissa matriiseissa, jotka sopivat toistettavaan näytteenottoon, voisi tarjota objektiivisia mittareita terapeuttisen lähestymistavan tehokkuudesta. Tässä ehdotuksessa yhdistämme kolmen eri italialaisen lääketieteellisen tutkimuskeskuksen asiantuntemuksen todentaaksemme erilaisia biologisia reittejä heijastavien biomarkkereiden kliinistä hyötyä, joukossa synukleinopatia, neurotulehdus, neurodegeneraatio, amyloidoosi ja tauopatia, erilaisissa biologisissa näytteissä soveltamalla immunoassayta, proximity extension assayta (PEA) ja seed amplification assayta (SAA).

Kunkin toimintayksikön toimintojen kuvaus ja jakelu Tutkimusryhmä koostuu kolmesta toimintayksiköstä (OU): Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) ja Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Kukin OU on vastuussa retrospektiivisten biologisten näytteiden valinnasta sekä potilaiden ja verrokkien rekrytoinnista tutkimuksen ensimmäisenä vuonna. Kaksi helposti saatavilla olevaa biologista näytettä, eli plasma ja hajuelimen limakalvo (OM), on kerätty/tullaan keräämään standardoiduilla menetelmillä kunkin OU:n toimesta PD-potilailta, verrokkiryhmiltä (terveet henkilöt ja potilaat, joilla on lieviä neurologisia häiriöitä, esim. päänsärky, psyykkiset häiriöt, subjektiiviset muistihäiriöt) ja Alzheimerin tautia (AD) sairastavilta potilailta muina neurodegeneratiivisten sairauksien verrokkeina. Ihopunkteja ja selkäydinnestettä (CSF), jotka ovat parillisia plasman ja OM-näytteiden kanssa, kerätään PD-potilailta ja verrokkiryhmiltä FINCB:ssä ja AOPG:ssä. Hankkeeseen sisältyy yhteensä 200 PD-potilasta (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 verrokkihenkilöä (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) ja 40 AD-potilasta (AOPG n = 40). Kaikki rekrytoidut PD-potilaat käyvät läpi kognitiivisen arvioinnin, joka sisältää (mutta ei rajoitu) Mini Mental State Examination (MMSE) ja Montreal Cognitive Assessment (MoCA), Movement Disorder Societyn kriteerien mukaisesti PD:n lievän kognitiivisen heikkouden arviointiin. Movement Disorders Society Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) täytetään sisältäen UPDRS-III-tutkimuksen, jota käytetään motorisen vaikeusasteen määrittämiseen "on"-motorisessa tilassa. Lisäksi sairauteen liittyvän vamman motorista vaikeusastetta arvioidaan Hoehn and Yahr -asteikolla (H&Y). PD-potilaat käyvät myös läpi hajutestit ennen OM-näytteenottoa. Verrokkiryhmä muodostuu terveistä vapaaehtoisista OM- ja plasma-keräystä varten sekä kognitiivisesti vailla heikkouksia olevista henkilöistä, joilla on subjektiivisia muistihäiriöitä tai lieviä neurologisia oireita. Edellä mainitut kliiniset tiedot on jo kerätty retrospektiiviselle kohortille. AOPG huolehtii plasma amyloid-β (Aβ) 42/Aβ40-suhteen ja threonini 181:ssä fosforyloidun taun (p-tau) mittauksesta Lumipulse-automatisoidulla alustalla. Osajoukossa 80 PD-potilasta ja 40 AD-potilasta näiden markkereiden CSF-tasot on jo mitattu ja niitä käytetään arvioimaan niiden CSF- ja plasma-tasojen välistä korrelaatiota. FINCB suorittaa SAA-analyysit OM- ja ihonäytteille aggregaatioherkän a-synukleiinin havaitsemiseksi sekä immunohistokemialliset analyysit ihonäytteille seriini 129:ssä fosforyloidun a-synukleiinin (p-a-syn) havaitsemiseksi. FINCB:llä on laaja asiantuntemus OM-näytteiden SAA-analyysissä ja ihopunkkien IHC-analyysissä. Tässä keskus laajentaa SAA-analyysin ihopunkkeihin tarkoituksena verrata p-a-syn:n diagnostista tarkkuutta vastaaviin SAA-löytöihin. Osajoukossa 30 PD- ja 30 AD/CTRL-potilasta, joilla on parilliset OM- ja CSF-näytteet, Amprion Inc.:n CSF SAA-protokollaa sovelletaan AOPG:ssä todentaakseen tulosten yhdenmukaisuuden CSF:n ja OM:n välillä. CNBP on erityisesti vastuussa kliinisten ja biomarkkeritietojen keräämisestä kolmesta keskuksesta ja niiden suhteiden arvioinnista. Mittausten yhtenäisyyden vuoksi PEA-analyysit keskitetään Olinkille (Uppsala, Ruotsi), jossa Olink Explore 384 Inflammation ja Olink Explore 384 Neurology -paneelit mitataan kaikissa plasmanäytteissä.

Erityiset tavoitteet ja kokeellinen suunnittelu

1. Määrittää erilaisten PD:n kliinisten fenotyyppien sormenjälki yhdistämällä OM:ssa ja plasmassa mitattuja biomarkkereita.
2. Arvioida kliinisten pisteytysten (hajutestit, MMSE, MoCA, UPDRS-III) ja mitattujen biomarkkereiden välistä korrelaatiota plasmassa ja OM:ssa.
3. Validoida synukleinopatia-, amyloidoosi- ja tauopatiamarkkereita parillisissa OM-, plasma-, CSF- ja ihonäytteissä.

Edellä kuvattujen tavoitteiden 1, 2 ja 3 saavuttamiseksi mitattavat biomarkkerit ovat:

• Ne, jotka mitataan plasmassa soveltamalla Olink Explore 384 Inflammation ja Neurology -paneelit; vastuussa näistä analyyseistä ovat tohtori Rossella Ciurleo ja tohtori Santina Caliri CNBP:stä, tohtori Lorenzo Gaetani ja professori Massimiliano Di Filippo AOPG:stä sekä tohtori Fabio Moda FINCB:stä.
• A-synukleiinin siemennyksellinen aktiivisuus OM- ja ihonäytteissä, jotka saadaan SAA:lla. Nämä analyysit keskitetään FINCB:lle ja ne suoritetaan tohtori Fabio Modan ja tohtori Chiara Maria Giulia De Lucan valvonnassa.
• Plasman Aβ42/Aβ20- ja p-tau-tasot. Nämä analyysit keskitetään AOPG:lle käyttäen Lumipulse-täysin automatisoitua alustaa professori Lucilla Parnettin ja tohtori Lorenzo Gaetanin valvonnassa.
• P-a-syn-kertymien havaitseminen ja karakterisointi ihopunkkeissa immunohistokemiallisia menetelmiä käyttäen. Tohtori Grazia Devigili on vastuussa tästä analyysistä. Vastuussa kliinisen datan keräämisestä kussakin keskuksessa ovat professori Lucilla Parnetti ja professori Massimiliano Di Filippo AOPG:lle, tohtori Paola Caroppo FINCB:lle ja tohtori Davide Cardile CNBP:lle. Datan analyysitehtävät, kullekin kolmesta kuvatusta tavoitteesta, koordinoi professori Lucilla Parnetti tohtori Santina Calirin ja tohtori Davide Cardilen avulla CNBP:ssä.