Verso la Caratterizzazione Molecolare della Malattia di Parkinson in Matrici Biologiche di Facile Accesso

Descrizione riassuntiva La malattia di Parkinson (PD) è la malattia neurodegenerativa più comune che coinvolge deficit motori invalidanti. La PD è clinicamente eterogenea, pertanto sono necessari biomarcatori che riflettano diversi aspetti fisiopatologici per la stratificazione e la selezione dei pazienti negli studi clinici. In questo progetto miriamo a misurare biomarcatori associati a diverse vie molecolari (ad esempio, sinucleinopatia, neuroinfiammazione, neurodegenerazione, amiloidosi e tauopatia) in diversi campioni biologici (liquido cerebrospinale, plasma, mucosa olfattiva e pelle) raccolti da una coorte di pazienti ben caratterizzati affetti da PD, altre malattie neurologiche/neurodegenerative e controlli. Tra i campioni considerati, la mucosa olfattiva e il plasma sono facilmente accessibili e quindi adatti per campionamenti ripetuti negli studi clinici. I diversi biomarcatori saranno associati a punteggi motori, neuropsicologici e funzionali per comprenderne la capacità di prevedere diversi esiti clinici.

Contesto / Stato dell'arte La malattia di Parkinson (PD) è una sinucleinopatia e la malattia neurodegenerativa più comune che coinvolge deficit motori invalidanti. La PD è clinicamente eterogenea; i sintomi motori possono essere accompagnati da sintomi non motori come il deterioramento cognitivo. Molti processi molecolari possono essere alla base dell'eterogeneità fenotipica della PD, tra cui la degenerazione sinaptica e assonale, la neuroinfiammazione e la co-occorrenza di diverse proteinopatie sono tra i più caratterizzati e quelli che hanno le migliori possibilità di essere riflessi in modo affidabile dai biomarcatori attualmente esistenti. Infatti, la definizione di biomarcatori robusti che riflettono distinti percorsi fisiopatologici che avvengono nella PD può favorire la selezione di coorti di pazienti più omogenee negli studi clinici, aumentando così la possibilità di successo di una terapia modificante la malattia che agisce su una o più di queste vie. Inoltre, la possibilità di misurare questi marcatori in matrici biologiche adatte per campionamenti ripetuti potrebbe fornire misure oggettive dell'efficacia dell'approccio terapeutico. In questa proposta combineremo l'esperienza di tre diversi centri di ricerca medica italiani per verificare l'utilità clinica di biomarcatori che riflettono diverse vie biologiche, tra cui sinucleinopatia, neuroinfiammazione, neurodegenerazione, amiloidosi e tauopatia, in diversi campioni biologici applicando immunoassay, saggi di estensione di prossimità (PEA) e saggi di amplificazione del seme (SAA).

Descrizione e distribuzione delle attività di ciascuna unità operativa Il gruppo di ricerca è composto da tre unità operative (OU): Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) e Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Ciascuna OU sarà responsabile della selezione dei campioni biologici retrospettivi e del reclutamento di pazienti e controlli nel primo anno dello studio. Due campioni biologici facilmente accessibili, ovvero plasma e OM, sono stati/saranno raccolti utilizzando procedure standardizzate da ciascuna OU da pazienti con PD, controlli (soggetti sani e pazienti affetti da disturbi neurologici minori, ad esempio, mal di testa, disturbi psichiatrici, disturbi soggettivi della memoria) e pazienti affetti da malattia di Alzheimer (AD) come controlli per altre malattie neurodegenerative. Biopsie cutanee e liquido cerebrospinale (CSF) accoppiati a campioni di plasma e OM vengono raccolti rispettivamente in pazienti con PD e controlli presso FINCB e AOPG. Il progetto includerà un numero totale di 200 pazienti con PD (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 controlli (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) e 40 AD (AOPG n = 40). Tutti i pazienti con PD che saranno reclutati subiranno una valutazione cognitiva che includerà (ma non limitata a) Mini Mental State Examination (MMSE) e Montreal Cognitive Assessment (MoCA), secondo i criteri della Movement Disorder Society per la valutazione del deterioramento cognitivo lieve nella PD. La Movement Disorders Society Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) sarà completata includendo l'esame UPDRS-III, che verrà utilizzato per determinare la gravità motoria nello stato motorio "on". Inoltre, la gravità motoria della disabilità correlata alla malattia sarà valutata mediante la scala di Hoehn e Yahr (H&Y). I pazienti con PD subiranno anche test olfattivi prima del campionamento OM. Il gruppo di controllo sarà costituito da volontari sani per la raccolta di OM e plasma, nonché da soggetti cognitivamente non compromessi affetti da disturbi soggettivi della memoria o da sintomi neurologici minori. Le informazioni cliniche sopra menzionate sono già state raccolte per la coorte retrospettiva. AOPG si occuperà della misurazione del rapporto plasmatico amiloide-β (Aβ) 42/Aβ40 e della tau fosforilata alla treonina 181 (p-tau) con la piattaforma automatizzata Lumipulse. In un sottoinsieme di 80 pazienti con PD e 40 AD, i livelli di CSF di questi marcatori sono già stati misurati e verranno utilizzati per valutare la correlazione tra i loro livelli di CSF e plasma. FINCB eseguirà analisi SAAs di campioni di OM e pelle per la rilevazione di a-sinucleina incline all'aggregazione e analisi immunoistochimiche di campioni di pelle per la rilevazione di a-sinucleina fosforilata alla serina 129 (p-a-syn). FINCB ha una vasta esperienza nell'analisi SAA di campioni di OM e nell'analisi IHC di biopsie cutanee. Qui, il centro estenderà l'analisi SAA a biopsie cutanee a punzone con l'obiettivo di confrontare l'accuratezza diagnostica di p-a-syn con i corrispondenti risultati SAA. In un sottoinsieme di 30 PD e 30 AD/CTRL con campioni di OM e CSF accoppiati, il protocollo CSF SAA di Amprion Inc. verrà applicato presso AOPG per verificare la concordanza dei risultati tra CSF e OM. CNBP sarà specificamente responsabile della raccolta dei dati clinici e dei biomarcatori dai tre centri e della valutazione delle loro relazioni. Per garantire l'uniformità delle misurazioni, le analisi PEA saranno invece centralizzate presso Olink (Uppsala, Svezia), dove verranno misurati i pannelli Olink Explore 384 Inflammation e Olink Explore 384 Neurology in tutti i campioni di plasma.

Obiettivi Specifici e Disegno Sperimentale

1. Determinare un'impronta digitale di diversi fenotipi clinici della PD combinando biomarcatori misurati in OM e plasma.
2. Valutare la correlazione tra punteggi clinici (test olfattivi, MMSE, MoCA, UPDRS-III) e biomarcatori misurati in plasma e OM.
3. Validare marcatori di sinucleinopatia, amiloidosi, tauopatia in campioni accoppiati di OM, plasma, CSF e pelle.

Per realizzare gli obiettivi 1, 2 e 3 sopra descritti, i biomarcatori che verranno misurati sono:

• Quelli misurati in plasma applicando i pannelli Olink Explore 384 Inflammation e Neurology; le persone responsabili di queste analisi sono la Dr.ssa Rossella Ciurleo e la Dr.ssa Santina Caliri per CNBP, il Dr. Lorenzo Gaetani e il Prof. Massimiliano Di Filippo per AOPG e il Dr. Fabio Moda per FINCB.
• L'attività di seeding dell'a-sinucleina in campioni di OM e pelle ottenuta mediante SAA. Queste analisi saranno centralizzate presso FINCB e saranno eseguite sotto la supervisione del Dr. Fabio Moda e della Dr.ssa Chiara Maria Giulia De Luca.
• Livelli plasmatici di Aβ42/Aβ20 e p-tau. Queste analisi saranno centralizzate presso AOPG utilizzando la piattaforma completamente automatizzata Lumipulse sotto la supervisione della Prof.ssa Lucilla Parnetti e del Dr. Lorenzo Gaetani.
• Rilevamento e caratterizzazione dei depositi di p-a-syn nelle biopsie cutanee, utilizzando metodi immunoistochimici. La Dr.ssa Grazia Devigili sarà responsabile di questa analisi. I responsabili della raccolta dei dati clinici in ciascun centro sono la Prof.ssa Lucilla Parnetti e il Prof. Massimiliano Di Filippo per AOPG, la Dr.ssa Paola Caroppo per FINCB e il Dr. Davide Cardile per CNBP. Il compito di analisi dei dati, per ciascuno dei tre obiettivi descritti, sarà invece coordinato dalla Prof.ssa Lucilla Parnetti con l'aiuto della Dr.ssa Santina Caliri e del Dr. Davide Cardile presso CNBP.