Hacia el Perfil Molecular de la Enfermedad de Parkinson en Matrices Biológicas de Fácil Acceso

Descripción resumida La enfermedad de Parkinson (EP) es la enfermedad neurodegenerativa más común que implica déficits motores incapacitantes. La EP es clínicamente heterogénea, por lo que se necesitan biomarcadores que reflejen diferentes aspectos fisiopatológicos para la estratificación y selección de pacientes en ensayos clínicos. En este proyecto, nuestro objetivo es medir biomarcadores asociados a diferentes vías moleculares (por ejemplo, sinucleinopatía, neuroinflamación, neurodegeneración, amiloidosis y tauopatía) en diferentes muestras biológicas (líquido cefalorraquídeo, plasma, mucosa olfatoria y piel) recogidas de una cohorte de pacientes bien caracterizados afectados por EP, otras enfermedades neurológicas/neurodegenerativas y controles. Entre las muestras consideradas, la mucosa olfatoria y el plasma son fácilmente accesibles y, por tanto, adecuados para un muestreo repetido en ensayos clínicos. Los diferentes biomarcadores se asociarán con puntuaciones motoras, neuropsicológicas y funcionales para comprender su capacidad para predecir diferentes resultados clínicos.

Antecedentes / Estado del arte La enfermedad de Parkinson (EP) es una sinucleinopatía y la enfermedad neurodegenerativa más común que implica déficits motores incapacitantes. La EP es clínicamente heterogénea; los síntomas motores pueden ir acompañados de síntomas no motores, como el deterioro cognitivo. Muchos procesos moleculares pueden subyacer a la heterogeneidad fenotípica de la EP, entre los cuales la degeneración sináptica y axonal, la neuroinflamación y la coexistencia de diferentes proteinopatías se encuentran entre los más caracterizados y aquellos que tienen más posibilidades de reflejarse de manera confiable mediante los biomarcadores existentes actualmente. De hecho, la definición de biomarcadores robustos que reflejen distintas vías fisiopatológicas que tienen lugar en la EP puede favorecer la selección de cohortes de pacientes más homogéneas en ensayos clínicos, aumentando así la posibilidad de éxito de una terapia modificadora de la enfermedad que actúe sobre una o más de estas vías. Además, la posibilidad de medir estos marcadores en matrices biológicas adecuadas para un muestreo repetido podría proporcionar medidas objetivas de la efectividad del enfoque terapéutico. En esta propuesta, combinaremos la experiencia de tres centros de investigación médica italianos diferentes para verificar la utilidad clínica de biomarcadores que reflejan diferentes vías biológicas, entre las cuales la sinucleinopatía, neuroinflamación, neurodegeneración, amiloidosis y tauopatía, en diferentes muestras biológicas aplicando inmunoensayos, ensayos de extensión por proximidad (PEA) y ensayos de amplificación de semillas (SAA).

Descripción y distribución de actividades de cada unidad operativa El grupo de investigación consta de tres unidades operativas (UO): Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) y Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Cada UO será responsable de la selección de muestras biológicas retrospectivas y del reclutamiento de pacientes y controles en el primer año del estudio. Dos muestras biológicas fácilmente accesibles, es decir, plasma y MO, han sido/serán recogidas utilizando procedimientos estandarizados por cada UO de pacientes con EP, controles (sujetos sanos y pacientes afectados por trastornos neurológicos menores, por ejemplo, dolor de cabeza, trastornos psiquiátricos, quejas subjetivas de memoria) y pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (EA) como otros controles de enfermedades neurodegenerativas. Las biopsias de piel y el líquido cefalorraquídeo (LCR) emparejados con muestras de plasma y MO se están recogiendo en pacientes con EP y controles en FINCB y AOPG, respectivamente. El proyecto incluirá un número total de 200 pacientes con EP (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 controles (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) y 40 EA (AOPG n = 40). Todos los pacientes con EP que serán reclutados se someterán a una evaluación cognitiva que incluye (pero no se limita a) el Mini Examen del Estado Mental (MMSE) y la Evaluación Cognitiva de Montreal (MoCA), de acuerdo con los criterios de la Sociedad de Trastornos del Movimiento para la evaluación del deterioro cognitivo leve en la EP. La Escala Unificada de Valoración de la Enfermedad de Parkinson de la Sociedad de Trastornos del Movimiento (UPDRS) se completará incluyendo el examen UPDRS-III, que se utilizará para determinar la gravedad motora en el estado motor "on". Además, la gravedad motora de la discapacidad relacionada con la enfermedad se evaluará mediante la escala de Hoehn y Yahr (H&Y). Los pacientes con EP también se someterán a pruebas de olfato antes del muestreo de MO. El grupo de control estará constituido por voluntarios sanos para la recolección de MO y plasma, así como por sujetos cognitivamente no afectados con quejas subjetivas de memoria o síntomas neurológicos menores. La información clínica mencionada anteriormente ya se ha recogido para la cohorte retrospectiva. AOPG se encargará de la medición de la relación amiloide-β (Aβ) 42/Aβ40 en plasma y tau fosforilada en treonina 181 (p-tau) con la plataforma automatizada Lumipulse. En un subconjunto de 80 pacientes con EP y 40 EA, los niveles en LCR de estos marcadores ya se han medido y se utilizarán para evaluar la correlación entre sus niveles en LCR y plasma. FINCB realizará análisis SAA de muestras de MO y piel para la detección de α-sinucleína propensa a agregación y análisis inmunohistoquímico de muestras de piel para la detección de α-sinucleína fosforilada en serina 129 (p-α-sin). FINCB tiene una amplia experiencia en análisis SAA de muestras de MO y análisis IHC de biopsias de piel. Aquí, el centro extenderá el análisis SAA a biopsias por punción de piel con el objetivo de comparar la precisión diagnóstica de p-α-sin con los hallazgos SAA correspondientes. En un subconjunto de 30 EP y 30 EA/CTRL con muestras emparejadas de MO y LCR, el protocolo SAA de LCR de Amprion Inc. se aplicará en AOPG para verificar la concordancia de los resultados entre LCR y MO. CNBP será específicamente responsable de recopilar datos clínicos y de biomarcadores de los tres centros y de evaluar sus relaciones. Por el bien de la uniformidad de las mediciones, los análisis PEA se centralizarán en Olink (Uppsala, Suecia), donde se medirán los paneles Olink Explore 384 Inflammation y Olink Explore 384 Neurology en todas las muestras de plasma.

Objetivos Específicos y Diseño Experimental

1. Determinar una huella dactilar de diferentes fenotipos clínicos de EP combinando biomarcadores medidos en MO y plasma.
2. Evaluar la correlación entre puntuaciones clínicas (pruebas de olfato, MMSE, MoCA, UPDRS-III) y biomarcadores medidos en plasma y MO.
3. Validar marcadores de sinucleinopatía, amiloidosis, tauopatía en muestras emparejadas de MO, plasma, LCR y piel.

Para cumplir los objetivos 1, 2 y 3 descritos anteriormente, los biomarcadores que se medirán son:

• Los medidos en plasma aplicando los paneles Olink Explore 384 Inflammation y Neurology; los responsables de estos análisis son la Dra. Rossella Ciurleo y la Dra. Santina Caliri para CNBP, el Dr. Lorenzo Gaetani y el Prof. Massimiliano Di Filippo para AOPG y el Dr. Fabio Moda para FINCB.
• La actividad de siembra de α-sinucleína en muestras de MO y piel obtenida mediante SAA. Estos análisis se centralizarán en FINCB y se realizarán bajo la supervisión del Dr. Fabio Moda y la Dra. Chiara Maria Giulia De Luca.
• Niveles plasmáticos de Aβ42/Aβ40 y p-tau. Estos análisis se centralizarán en AOPG utilizando la plataforma totalmente automatizada Lumipulse bajo la supervisión de la Prof. Lucilla Parnetti y el Dr. Lorenzo Gaetani.
• Detección y caracterización de depósitos de p-α-sin en biopsias de piel, utilizando métodos inmunohistoquímicos. La Dra. Grazia Devigili será responsable de este análisis. Los responsables de la recolección de datos clínicos en cada centro son la Prof. Lucilla Parnetti y el Prof. Massimiliano Di Filippo para AOPG, la Dra. Paola Caroppo para FINCB y el Dr. Davide Cardile para CNBP. La tarea de análisis de datos, para cada uno de los tres objetivos descritos, será coordinada por la prof. Lucilla Parnetti con la ayuda de la Dra. Santina Caliri y el Dr. Davide Cardile en CNBP.