A Parkinson-kór molekuláris profilozása felé könnyen hozzáférhető biológiai mátrixokban

Összefoglaló leírás A Parkinson-kór (PD) a leggyakoribb neurodegeneratív betegség, amely fogyatékossággal járó motoros hiányosságokat von maga után. A PD klinikailag heterogén, így a klinikai vizsgálatokban a betegek rétegezéséhez és kiválasztásához a különböző patofiziológiai aspektusokat tükröző biomarkerre van szükség. Ebben a projektben célunk, hogy különböző molekuláris útvonalakhoz (pl. szinukleinopátia, neurogyulladás, neurodegeneráció, amiloidózis és tauopátia) kapcsolódó biomarkereket mérjünk különböző biológiai mintákban (agytörzsi folyadék, plazma, szaglóhártya és bőr), amelyeket egy jellemzett PD-ben szenvedő betegekből, más neurológiai/neurodegeneratív betegségekből és kontrollokból álló kohorszban gyűjtünk. A figyelembe vett minták közül a szaglóhártya és a plazma könnyen hozzáférhető, így alkalmasak az ismételt mintavételre a klinikai vizsgálatokban. A különböző biomarkereket motoros, neuropszichológiai és funkcionális pontszámokkal társítjuk, hogy megértsük képességüket a különböző klinikai eredmények előrejelzésére.

Háttér / Jelenlegi állás A Parkinson-kór (PD) egy szinukleinopátia és a leggyakoribb neurodegeneratív betegség, amely fogyatékossággal járó motoros hiányosságokat von maga után. A PD klinikailag heterogén; a motoros tüneteket nem motoros tünetek kísérhetik, például kognitív zavarok. Számos molekuláris folyamat állhat a PD fenotípusos heterogenitása mögött, amelyek közül a szinaptikus és axonális degeneráció, a neurogyulladás és a különböző proteinopátiák együttes előfordulása a legjobban jellemzettek és azok, amelyeknek a legnagyobb esélye van, hogy a jelenleg létező biomarkerek megbízhatóan tükrözzék őket. Valójában a PD-ben zajló különálló patofiziológiai útvonalakat tükröző robusztus biomarkerek meghatározása elősegítheti a homogénebb betegkohorszok kiválasztását a klinikai vizsgálatokban, ezzel növelve annak esélyét, hogy egy vagy több ilyen útvonalon ható betegségmódosító terápia sikeres legyen. Továbbá, ezeknek a markereknek a mérése az ismételt mintavételre alkalmas biológiai mátrixokban objektív mérőszámokat nyújthat a terápiás megközelítés hatékonyságáról. Ebben a javaslatban három különböző olasz orvosi kutatóközpont szakértelmét fogjuk kombinálni, hogy ellenőrizzük a különböző biológiai útvonalakat (köztük a szinukleinopátiát, neurogyulladást, neurodegenerációt, amiloidózist és tauopátiát) tükröző biomarkerek klinikai hasznosságát különböző biológiai mintákban, immunvizsgálatok, közelségi kiterjesztési vizsgálatok (PEA) és magképződési amplifikációs vizsgálatok (SAA) alkalmazásával.

Az egyes működési egységek tevékenységeinek leírása és megoszlása A kutatócsoport három működési egységből (OU) áll: Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) és Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Minden OU felelős lesz a retrospektív biológiai minták kiválasztásáért és a betegek és kontrollok toborzásáért a tanulmány első évében. Két könnyen hozzáférhető biológiai mintát, nevezetesen a plazmát és a szaglóhártyát (OM), minden OU szabványos eljárásokkal gyűjtött/gyűjt PD-betegektől, kontrolloktól (egészséges személyek és kisebb neurológiai zavarokban, pl. fejfájás, pszichiátriai zavarok, szubjektív memóriapanaszok) szenvedő betegek) és Alzheimer-kórban (AD) szenvedő betegektől, mint más neurodegeneratív betegségű kontrolloktól. Bőrbiopsziákat és agytörzsi folyadékot (CSF) a plazma és OM mintákhoz párosítva gyűjtenek PD-betegektől és kontrolloktól a FINCB-nél, illetve az AOPG-nél. A projekt összesen 200 PD-betegből (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 kontrollból (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) és 40 AD-betegből (AOPG n = 40) fog állni. Minden toborzott PD-beteg kognitív értékelésen esik át, amely tartalmazza (de nem korlátozódik) a Mini Mental State Examination (MMSE) és a Montreal Cognitive Assessment (MoCA) vizsgálatokat, a Mozgászavari Társaság kritériumainak megfelelően a PD-ben fellépő enyhe kognitív zavar értékelésére. A Mozgászavari Társaság Egységes Parkinson-kór Értékelési Skálája (UPDRS) kitöltésre kerül, beleértve az UPDRS-III vizsgálatot, amelyet a motoros súlyosság meghatározására használnak a "bekapcsolt" motoros állapotban. Továbbá, a betegséghez kapcsolódó fogyatékosság motoros súlyosságát a Hoehn és Yahr skála (H&Y) segítségével értékelik. A PD-betegek szagteszteken is átesnek az OM mintavétel előtt. A kontrollcsoportot egészséges önkéntesek alkotják az OM és plazmagyűjtéshez, valamint szubjektív memóriapanaszokkal vagy kisebb neurológiai tünetekkel küzdő, kognitívan érintetlen személyek. A fent említett klinikai információkat már gyűjtötték a retrospektív kohorszhoz. Az AOPG gondoskodik a plazma amiloid-ß (Aß) 42/Aß40 arány és a treonin 181-nél foszforilált tau (p-tau) méréséről a Lumipulse automatizált platformmal. Egy 80 PD-betegből és 40 AD-betegből álló alcsoportban ezen markerek CSF-szintjeit már megmérték, és felhasználják a CSF- és plazmaszintjeik közötti korreláció felmérésére. A FINCB SAA-elemzéseket végez az OM és bőrmintákon az aggregálásra hajlamos a-szinuklein kimutatására, valamint immunhisztokémiai elemzéseket a bőrmintákon a szerin 129-nél foszforilált a-szinuklein (p-a-szin) kimutatására. A FINCB-nél kiterjedt szakértelem áll rendelkezésre az OM minták SAA-elemzésében és a bőrbiopsziák IHC-elemzésében. Itt a központ kiterjeszti a SAA-elemzést bőrpuncs biopsziákra azzal a céllal, hogy összehasonlítsa a p-a-szin diagnosztikai pontosságát a megfelelő SAA-eredményekkel. Egy 30 PD- és 30 AD/CTRL-ből álló alcsoportban, párosított OM és CSF mintákkal, az Amprion Inc. CSF SAA protokollját alkalmazzák az AOPG-nál, hogy ellenőrizzék az eredmények egyezését a CSF és OM között. A CNBP kifejezetten felelős lesz a klinikai és biomarker adatok gyűjtéséért a három központból és azok kapcsolatainak felméréséért. A mérések egységességének érdekében a PEA-elemzéseket inkább centralizálják az Olink-nél (Uppsala, Svédország), ahol az Olink Explore 384 Gyulladás és Olink Explore 384 Neurológia paneleket mérik meg minden plazmamintában.

Specifikus célok és kísérleti tervezés

1. Különböző PD klinikai fenotípusok ujjlenyomatának meghatározása az OM-ben és plazmában mért biomarkerek kombinálásával.
2. A klinikai pontszámok (szagtesztek, MMSE, MoCA, UPDRS-III) és a plazmában és OM-ben mért biomarkerek közötti korreláció értékelése.
3. Szinukleinopátia, amiloidózis, tauopátia markerek validálása párosított OM, plazma, CSF és bőrmintákban.

A fent leírt 1., 2. és 3. célok eléréséhez a mérendő biomarkerek a következők:

• Azok, amelyeket plazmában mérnek az Olink Explore 384 Gyulladás és Neurológia panelek alkalmazásával. Ezeknek az elemzéseknek a felelősei Dr. Rossella Ciurleo és Dr. Santina Caliri a CNBP-nél, Dr. Lorenzo Gaetani és Prof. Massimiliano Di Filippo az AOPG-nál, valamint Dr. Fabio Moda a FINCB-nél.
• Az a-szinuklein magképződési aktivitása az OM-ben és bőrmintákban, amelyet SAA segítségével nyernek. Ezeket az elemzéseket a FINCB-nél centralizálják, és Dr. Fabio Moda és Dr. Chiara Maria Giulia De Luca felügyelete alatt végzik.
• Aß42/Aß20 és p-tau plazmaszintjei. Ezeket az elemzéseket az AOPG-nál centralizálják a Lumipulse teljesen automatizált platform használatával Prof. Lucilla Parnetti és Dr. Lorenzo Gaetani felügyelete alatt.
• P-a-szin lerakódások kimutatása és jellemzése bőrbiopsziákban, immunhisztokémiai módszerek alkalmazásával. Dr. Grazia Devigili lesz felelős ezért az elemzésért. A klinikai adatok gyűjtéséért felelős minden központban Prof. Lucilla Parnetti és Prof. Massimiliano Di Filippo az AOPG-nál, Dr. Paola Caroppo a FINCB-nél és Dr. Davide Cardile a CNBP-nél. Az adatelemzési feladatot, a leírt három cél mindegyikére, Prof. Lucilla Parnetti koordinálja Dr. Santina Caliri és Dr. Davide Cardile segítségével a CNBP-nél.