W kierunku profilowania molekularnego choroby Parkinsona w łatwo dostępnych matrycach biologicznych

Opis ogólny Choroba Parkinsona (PD) jest najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną, obejmującą upośledzające deficyty motoryczne. PD jest klinicznie heterogenna, dlatego biomarkery odzwierciedlające różne aspekty patofizjologiczne są potrzebne do stratyfikacji i selekcji pacjentów w badaniach klinicznych. W tym projekcie zamierzamy mierzyć biomarkery związane z różnymi szlakami molekularnymi (np. synukleinopatia, neurozapalenie, neurodegeneracja, amyloidoza i tauopatia) w różnych próbkach biologicznych (płyn mózgowo-rdzeniowy, osocze, błona śluzowa nosa i skóra) pobranych od kohorty dobrze scharakteryzowanych pacjentów z PD, innymi chorobami neurologicznymi/neurodegeneracyjnymi oraz od grupy kontrolnej. Spośród rozważanych próbek, błona śluzowa nosa i osocze są łatwo dostępne, a zatem nadają się do powtarzanego pobierania w badaniach klinicznych. Różne biomarkery będą powiązane z wynikami motorycznymi, neuropsychologicznymi i funkcjonalnymi, aby zrozumieć ich zdolność do przewidywania różnych wyników klinicznych.

Tło / Stan wiedzy Choroba Parkinsona (PD) jest synukleinopatią i najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną, obejmującą upośledzające deficyty motoryczne. PD jest klinicznie heterogenna; objawy motoryczne mogą być towarzyszone przez objawy niemotoryczne, takie jak zaburzenia poznawcze. Wiele procesów molekularnych może leżeć u podstaw fenotypowej heterogenności PD, wśród których degeneracja synaptyczna i aksonalna, neurozapalenie oraz współwystępowanie różnych proteinopatii są jednymi z najlepiej scharakteryzowanych i mają największe szanse na wiarygodne odzwierciedlenie przez obecnie istniejące biomarkery. W rzeczywistości, zdefiniowanie solidnych biomarkerów, które odzwierciedlają odrębne szlaki patofizjologiczne zachodzące w PD, może sprzyjać selekcji bardziej jednorodnych kohort pacjentów w badaniach klinicznych, zwiększając tym samym szansę na sukces terapii modyfikującej przebieg choroby, działającej na jeden lub więcej z tych szlaków. Ponadto, możliwość pomiaru tych markerów w matrycach biologicznych nadających się do powtarzanego pobierania może dostarczyć obiektywnych miar skuteczności podejścia terapeutycznego. W tej propozycji połączymy ekspertyzę trzech różnych włoskich ośrodków badawczych medycyny, aby zweryfikować użyteczność kliniczną biomarkerów odzwierciedlających różne szlaki biologiczne, wśród których synukleinopatia, neurozapalenie, neurodegeneracja, amyloidoza i tauopatia, w różnych próbkach biologicznych, stosując testy immunologiczne, testy rozszerzania bliskości (PEA) oraz testy amplifikacji nasion (SAA).

Opis i podział działań każdej jednostki operacyjnej Grupa badawcza składa się z trzech jednostek operacyjnych (OU): Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) oraz Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Każda OU będzie odpowiedzialna za selekcję retrospektywnych próbek biologicznych oraz rekrutację pacjentów i grupy kontrolnej w pierwszym roku badania. Dwie łatwo dostępne próbki biologiczne, tj. osocze i błona śluzowa nosa (OM), zostały/będą pobierane przy użyciu ustandaryzowanych procedur przez każdą OU od pacjentów z PD, grupy kontrolnej (zdrowych osób oraz pacjentów z niewielkimi zaburzeniami neurologicznymi, np. bólami głowy, zaburzeniami psychicznymi, subiektywnymi skargami na pamięć) oraz pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) jako innych neurodegeneracyjnych kontroli. Biopsje skóry i płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) sparowane z próbkami osocza i OM są pobierane u pacjentów z PD i grupy kontrolnej odpowiednio w FINCB i AOPG. Projekt obejmie łącznie 200 pacjentów z PD (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 kontroli (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) oraz 40 AD (AOPG n = 40). Wszyscy rekrutowani pacjenci z PD przejdą ocenę poznawczą, obejmującą (ale nie ograniczającą się do) Mini Mental State Examination (MMSE) i Montreal Cognitive Assessment (MoCA), zgodnie z kryteriami Movement Disorder Society do oceny łagodnych zaburzeń poznawczych w PD. Movement Disorders Society Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) zostanie uzupełniona o badanie UPDRS-III, które zostanie wykorzystane do określenia ciężkości motorycznej w stanie motorycznym "on". Ponadto, ciężkość motoryczna niepełnosprawności związanej z chorobą będzie oceniana za pomocą skali Hoehn i Yahr (H&Y). Pacjenci z PD przejdą również testy węchowe przed pobraniem OM. Grupa kontrolna będzie składać się ze zdrowych ochotników do pobrania OM i osocza oraz osób bez zaburzeń poznawczych z subiektywnymi skargami na pamięć lub niewielkimi objawami neurologicznymi. Powyższe informacje kliniczne zostały już zebrane dla kohorty retrospektywnej. AOPG zajmie się pomiarem stosunku amyloidu-β (Aβ) 42/Aβ40 oraz fosforylowanej w treoninie 181 tau (p-tau) w osoczu za pomocą zautomatyzowanej platformy Lumipulse. W podgrupie 80 pacjentów z PD i 40 AD, poziomy tych markerów w CSF zostały już zmierzone i zostaną wykorzystane do oceny korelacji między ich poziomami w CSF i osoczu. FINCB przeprowadzi analizy SAA próbek OM i skóry w celu wykrycia podatnego na agregację α-synukleiny oraz analizy immunohistochemiczne próbek skóry w celu wykrycia α-synukleiny fosforylowanej w serynie 129 (p-α-syn). FINCB ma bogate doświadczenie w analizach SAA próbek OM i analizach IHC biopsji skóry. Tutaj ośrodek rozszerzy analizy SAA na biopsje skóry z zamiarem porównania dokładności diagnostycznej p-α-syn z odpowiednimi wynikami SAA. W podgrupie 30 PD i 30 AD/CTRL z sparowanymi próbkami OM i CSF, protokół SAA CSF firmy Amprion Inc. zostanie zastosowany w AOPG w celu weryfikacji zgodności wyników między CSF i OM. CNBP będzie szczególnie odpowiedzialny za gromadzenie danych klinicznych i biomarkerów z trzech ośrodków oraz ocenę ich relacji. Dla jednolitości pomiarów, analizy PEA będą scentralizowane w Olink (Uppsala, Szwecja), gdzie panele Olink Explore 384 Inflammation i Olink Explore 384 Neurology zostaną zmierzone we wszystkich próbkach osocza.

Specyficzne cele i projekt eksperymentalny

1. Określenie odcisku palca różnych fenotypów klinicznych PD poprzez połączenie biomarkerów mierzonych w OM i osoczu.
2. Ocena korelacji między wynikami klinicznymi (testy węchowe, MMSE, MoCA, UPDRS-III) a zmierzonymi biomarkerami w osoczu i OM.
3. Walidacja markerów synukleinopatii, amyloidozy, tauopatii w sparowanych próbkach OM, osocza, CSF i skóry.

Aby osiągnąć opisane powyżej cele 1, 2 i 3, biomarkery, które zostaną zmierzone, to:

• Te mierzone w osoczu poprzez zastosowanie paneli Olink Explore 384 Inflammation i Neurology; osoby odpowiedzialne za te analizy to dr Rossella Ciurleo i dr Santina Caliri dla CNBP, dr Lorenzo Gaetani i prof. Massimiliano Di Filippo dla AOPG oraz dr Fabio Moda dla FINCB.
• Aktywność nasion α-synukleiny w próbkach OM i skóry uzyskana za pomocą SAA. Analizy te będą scentralizowane w FINCB i będą przeprowadzane pod nadzorem dr Fabio Moda i dr Chiara Maria Giulia De Luca.
• Poziomy Aß42/Aß40 i p-tau w osoczu. Analizy te będą scentralizowane w AOPG przy użyciu w pełni zautomatyzowanej platformy Lumipulse pod nadzorem prof. Lucilla Parnetti i dr Lorenzo Gaetani.
• Wykrywanie i charakterystyka złogów p-α-syn w biopsjach skóry, przy użyciu metod immunohistochemicznych. Dr Grazia Devigili będzie odpowiedzialna za tę analizę. Odpowiedzialni za zbieranie danych klinicznych w każdym ośrodku to prof. Lucilla Parnetti i prof. Massimiliano Di Filippo dla AOPG, dr Paola Caroppo dla FINCB i dr Davide Cardile dla CNBP. Zadanie analizy danych, dla każdego z trzech opisanych celów, będzie koordynowane przez prof. Lucilla Parnetti z pomocą dr Santina Caliri i dr Davide Cardile w CNBP.