K molekulárnímu profilování Parkinsonovy choroby v snadno dostupných biologických matricích

Souhrnný popis Parkinsonova choroba (PD) je nejčastější neurodegenerativní onemocnění spojené s invalidizujícími motorickými deficity. PD je klinicky heterogenní, proto jsou pro stratifikaci a výběr pacientů v klinických studiích potřebné biomarkery odrážející různé patofyziologické aspekty. V tomto projektu se zaměřujeme na měření biomarkerů spojených s různými molekulárními drahami (např. synukleinopatie, neurozánět, neurodegenerace, amyloidóza a tauopatie) v různých biologických vzorcích (mozkomíšní mok, plazma, čichová sliznice a kůže) odebraných z kohorty dobře charakterizovaných pacientů postižených PD, dalšími neurologickými/neurodegenerativními chorobami a kontrolními subjekty. Mezi uvažovanými vzorky jsou čichová sliznice a plazma snadno dostupné, a tedy vhodné pro opakované odběry v klinických studiích. Různé biomarkery budou spojeny s motorickými, neuropsychologickými a funkčními skóre, aby bylo možné porozumět jejich schopnosti předpovídat různé klinické výsledky.

Pozadí / Stav vědomostí Parkinsonova choroba (PD) je synukleinopatie a nejčastější neurodegenerativní onemocnění spojené s invalidizujícími motorickými deficity. PD je klinicky heterogenní; motorické příznaky mohou být doprovázeny nemotorickými příznaky, jako je kognitivní porucha. Mnoho molekulárních procesů může být základem fenotypové heterogenity PD, mezi nimiž jsou synaptická a axonální degenerace, neurozánět a souběh různých proteinopatií jedny z nejlépe charakterizovaných a těch, které mají největší šanci být spolehlivě odraženy současnými existujícími biomarkery. Ve skutečnosti definice robustních biomarkerů, které odrážejí odlišné patofyziologické dráhy probíhající v PD, může podpořit výběr homogennějších kohort pacientů v klinických studiích, čímž se zvyšuje šance na úspěch terapie modifikující onemocnění, která působí na jednu nebo více těchto drah. Navíc možnost měření těchto markerů v biologických matricích vhodných pro opakované odběry by mohla poskytnout objektivní měřítka účinnosti terapeutického přístupu. V tomto návrhu zkombinujeme odborné znalosti tří různých italských lékařských výzkumných center, abychom ověřili klinickou užitečnost biomarkerů odrážejících různé biologické dráhy, mezi nimiž jsou synukleinopatie, neurozánět, neurodegenerace, amyloidóza a tauopatie, v různých biologických vzorcích pomocí imunoanalýz, proximity extension assays (PEA) a seed amplification assays (SAA).

Popis a rozdělení činností každé operační jednotky Výzkumná skupina se skládá ze tří operačních jednotek (OU): Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) a Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Každá OU bude odpovědná za výběr retrospektivních biologických vzorků a za nábor pacientů a kontrol v prvním roce studie. Dva snadno dostupné biologické vzorky, tj. plazma a OM, byly/budou odebírány pomocí standardizovaných postupů každou OU od pacientů s PD, kontrol (zdravých subjektů a pacientů postižených menšími neurologickými poruchami, např. bolestmi hlavy, psychiatrickými poruchami, subjektivními stížnostmi na paměť) a pacientů postižených Alzheimerovou chorobou (AD) jako jiných neurodegenerativních onemocnění kontrol. Kožní biopsie a mozkomíšní mok (CSF) spárované s plazmatickými a OM vzorky jsou odebírány u pacientů s PD a kontrol u FINCB a AOPG, resp. Projekt bude zahrnovat celkový počet 200 pacientů s PD (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 kontrol (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) a 40 AD (AOPG n = 40). Všichni náboroví pacienti s PD podstoupí kognitivní hodnocení včetně (ale ne omezeno na) Mini Mental State Examination (MMSE) a Montreal Cognitive Assessment (MoCA), podle kritérií Movement Disorder Society pro hodnocení mírné kognitivní poruchy u PD. Movement Disorders Society Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) bude vyplněna včetně vyšetření UPDRS-III, které bude použito k určení motorické závažnosti v "on" motorickém stavu. Také motorická závažnost onemocnění související s invaliditou bude hodnocena pomocí stupnice Hoehn a Yahr (H&Y). Pacienti s PD také podstoupí testy čichu před odběrem OM. Kontrolní skupina bude tvořena zdravými dobrovolníky pro odběr OM a plazmy, stejně jako kognitivně neporušenými subjekty postiženými subjektivními stížnostmi na paměť nebo menšími neurologickými příznaky. Výše uvedené klinické informace již byly shromážděny pro retrospektivní kohortu. AOPG se postará o měření poměru plazmatického amyloidu-β (Aβ) 42/Aβ40 a tau fosforylovaného na threoninu 181 (p-tau) pomocí automatizované platformy Lumipulse. V podskupině 80 pacientů s PD a 40 AD byly hladiny těchto markerů v CSF již změřeny a budou použity k posouzení korelace mezi jejich hladinami v CSF a plazmě. FINCB provede analýzy SAA vzorků OM a kůže pro detekci a-synukleinu náchylného k agregaci a imunohistochemickou analýzu vzorků kůže pro detekci a-synukleinu fosforylovaného na serinu 129 (p-a-syn). FINCB má rozsáhlé zkušenosti s analýzou SAA vzorků OM a IHC analýzou kožních biopsií. Zde centrum rozšíří analýzu SAA na punch biopsie kůže s cílem porovnat diagnostickou přesnost p-a-syn s odpovídajícími nálezy SAA. V podskupině 30 PD a 30 AD/CTRL se spárovanými vzorky OM a CSF bude protokol CSF SAA společnosti Amprion Inc. aplikován v AOPG k ověření shody výsledků mezi CSF a OM. CNBP bude konkrétně odpovědné za sběr klinických a biomarkerových dat ze tří center a za posouzení jejich vztahů. Pro zajištění jednotnosti měření budou analýzy PEA centralizovány v Olink (Uppsala, Švédsko), kde budou v plazmatických vzorcích měřeny panely Olink Explore 384 Inflammation a Olink Explore 384 Neurology.

Specifické cíle a experimentální design

1. Stanovit otisk různých klinických fenotypů PD kombinací biomarkerů měřených v OM a plazmě.
2. Vyhodnotit korelaci mezi klinickými skóre (testy čichu, MMSE, MoCA, UPDRS-III) a měřenými biomarkery v plazmě a OM.
3. Validovat markery synukleinopatie, amyloidózy, tauopatie ve spárovaných vzorcích OM, plazmy, CSF a kůže.

K dosažení výše popsaných cílů 1, 2 a 3 budou měřeny následující biomarkery:

• Ty měřené v plazmě pomocí panelů Olink Explore 384 Inflammation a Neurology; odpovědní za tyto analýzy jsou Dr. Rossella Ciurleo a Dr. Santina Caliri pro CNBP, Dr. Lorenzo Gaetani a Prof. Massimiliano Di Filippo pro AOPG a Dr. Fabio Moda pro FINCB.
• Aktivita a-synukleinu pro klíčení ve vzorcích OM a kůže získaná pomocí SAA. Tyto analýzy budou centralizovány v FINCB a budou provedeny pod dohledem Dr. Fabia Mody a Dr. Chiary Marie Giulie De Lucové.
• Hladiny Aß42/Aß20 a p-tau v plazmě. Tyto analýzy budou centralizovány v AOPG pomocí plně automatizované platformy Lumipulse pod dohledem Prof. Lucilly Parnettiové a Dr. Lorenza Gaetaniho.
• Detekce a charakterizace depozit p-a-syn v kožních biopsiích pomocí imunohistochemických metod. Za tuto analýzu bude odpovědná Dr. Grazia Devigili. Odpovědní za sběr klinických dat v každém centru jsou Prof. Lucilla Parnettiová a Prof. Massimiliano Di Filippo pro AOPG, Dr. Paola Caroppová pro FINCB a Dr. Davide Cardile pro CNBP. Úkol analýzy dat pro každý ze tří popsaných cílů bude koordinován prof. Lucillou Parnettiovou s pomocí Dr. Santiny Caliriové a Dr. Davide Cardileho v CNBP.