Mot molekylær profilering av Parkinsons sykdom i lett tilgjengelige biologiske matriser

Sammendrag Parkinsons sykdom (PD) er den vanligste nevrodegenerative sykdommen som innebærer invalidiserende motoriske mangler. PD er klinisk heterogen, derfor trengs biomarkører som reflekterer ulike patofysiologiske aspekter for stratifisering og utvalg av pasienter i kliniske studier. I dette prosjektet tar vi sikte på å måle biomarkører knyttet til ulike molekylære veier (f.eks. synukleinopati, nevroinflammasjon, nevrodegenerasjon, amyloidose og tauopati) i ulike biologiske prøver (ryggmargsveske, plasma, lukteslimhinne og hud) innsamlet fra en kohort av godt karakteriserte pasienter rammet av PD, andre nevrologiske/nevrodegenerative sykdommer og kontroller. Blant prøvene som vurderes, er lukteslimhinne og plasma lett tilgjengelige og dermed egnet for gjentatt prøvetaking i kliniske studier. De ulike biomarkørene vil bli assosiert med motoriske, nevropsykologiske og funksjonelle skårer for å forstå deres evne til å forutsi ulike kliniske utfall.

Bakgrunn / Stand av teknologien Parkinsons sykdom (PD) er en synukleinopati og den vanligste nevrodegenerative sykdommen som innebærer invalidiserende motoriske mangler. PD er klinisk heterogen; motorsymptomer kan være ledsaget av ikke-motoriske symptomer som kognitiv svikt. Mange molekylære prosesser kan ligge til grunn for den fenotypiske heterogeniteten ved PD, hvorav synaptisk og aksonal degenerasjon, nevroinflammasjon, og samtidig forekomst av ulike proteinopatier er blant de mest karakteriserte og de som har størst sjanse for å bli pålitelig reflektert av eksisterende biomarkører. Faktisk kan definisjonen av robuste biomarkører som reflekterer distinkte patofysiologiske veier som finner sted i PD favorisere utvalget av mer homogene kohorter av pasienter i kliniske studier, og dermed øke sjansen for suksess for en sykdomsmodifiserende terapi som virker på en eller flere av disse veiene. Dessuten kan muligheten til å måle disse markørene i biologiske matriser egnet for gjentatt prøvetaking gi objektive mål for effektiviteten av den terapeutiske tilnærmingen. I dette forslaget vil vi kombinere ekspertisen til tre forskjellige italienske medisinske forskningssentre for å verifisere den kliniske nytten av biomarkører som reflekterer ulike biologiske veier, blant annet synukleinopati, nevroinflammasjon, nevrodegenerasjon, amyloidose og tauopati, i ulike biologiske prøver ved å anvende immunoassays, proximity extension assays (PEA) og seed amplification assays (SAA).

Beskrivelse og fordeling av aktiviteter for hver operasjonsenhet Forskningsgruppen består av tre operasjonsenheter (OU): Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) og Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Hver OU vil være ansvarlig for utvalget av retrospektive biologiske prøver og for rekruttering av pasienter og kontroller i det første året av studien. To lett tilgjengelige biologiske prøver, dvs. plasma og OM, er blitt/vil bli samlet inn ved bruk av standardiserte prosedyrer av hver OU fra PD-pasienter, kontroller (friske personer og pasienter rammet av mindre nevrologiske forstyrrelser, f.eks. hodepine, psykiatriske lidelser, subjektive hukommelsesklager) og pasienter rammet av Alzheimers sykdom (AD) som andre nevrodegenerative sykdomskontroller. Hudbiopsier og ryggmargsveske (CSF) sammenkoblet med plasma- og OM-prøver blir samlet inn hos PD-pasienter og kontroller ved henholdsvis FINCB og AOPG. Prosjektet vil inkludere et totalt antall på 200 PD-pasienter (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 kontroller (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) og 40 AD (AOPG n = 40). Alle PD-pasienter som vil bli rekruttert, vil gjennomgå kognitiv evaluering inkludert (men ikke begrenset til) Mini Mental State Examination (MMSE) og Montreal Cognitive Assessment (MoCA), i henhold til Movement Disorder Society-kriteriene for vurdering av mild kognitiv svikt ved PD. Movement Disorders Society Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) vil bli fullført inkludert UPDRS-III-undersøkelsen, som vil bli brukt til å bestemme motorisk alvorlighet i "on"-motorstatusen. Også motorisk alvorlighet av sykdomsrelatert funksjonshemming vil bli vurdert ved hjelp av Hoehn og Yahr-skalaen (H&Y). PD-pasienter vil også gjennomgå luktetester før OM-prøvetaking. Kontrollgruppen vil være sammensatt av friske frivillige for OM- og plasmainnsamling så vel som av kognitivt upåvirkede personer rammet av subjektive hukommelsesklager eller mindre nevrologiske symptomer. Den ovennevnte kliniske informasjonen er allerede innsamlet for den retrospektive kohorten. AOPG vil ta seg av målingen av plasma amyloid-β (Aβ) 42/Aβ40-forholdet og fosforylert ved treonin 181 tau (p-tau) med Lumipulse automatiserte plattform. I en undergruppe på 80 PD-pasienter og 40 AD er CSF-nivåene av disse markørene allerede målt og vil bli brukt til å vurdere korrelasjonen mellom deres CSF- og plasmanivåer. FINCB vil utføre SAA-analyser av OM- og hudprøver for deteksjon av tilbøyelig til aggregasjon a-synuklein og immunhistokjemisk analyse av hudprøver for deteksjon av a-synuklein fosforylert ved serin 129 (p-a-syn). FINCB har omfattende ekspertise i SAA-analyse av OM-prøver og IHC-analyse av hudbiopsier. Her vil senteret utvide SAA-analyse til hud punch-biopsier med mål om å sammenligne den diagnostiske nøyaktigheten av p-a-syn med de tilsvarende SAA-funnene. I en undergruppe på 30 PD og 30 AD/CTRL med sammenkoblede OM- og CSF-prøver vil CSF SAA-protokollen til Amprion Inc. bli anvendt ved AOPG for å verifisere resultatenes overensstemmelse mellom CSF og OM. CNBP vil være spesifikt ansvarlig for innsamling av kliniske og biomarkørdata fra de tre sentrene og for å vurdere deres sammenhenger. For målenes ensartethets skyld vil PEA-analysene i stedet bli sentralisert hos Olink (Uppsala, Sverige), hvor Olink Explore 384 Inflammation og Olink Explore 384 Neurology panels vil bli målt i alle plasmaprøver.

Spesifikke mål og eksperimentell design

1. Å bestemme et fingeravtrykk av ulike kliniske fenotyper av PD ved å kombinere biomarkører målt i OM og plasma.
2. Å evaluere korrelasjonen mellom kliniske skårer (luktetester, MMSE, MoCA, UPDRS-III) og målte biomarkører i plasma og OM.
3. Å validere synukleinopati-, amyloidose-, tauopati-markører i sammenkoblede OM-, plasma-, CSF- og hudprøver.

For å oppnå de ovenfor beskrevne målene 1, 2 og 3, er biomarkørene som vil bli målt:

• De som måles i plasma ved å anvende Olink Explore 384 Inflammation og Neurology panels; de ansvarlige for disse analysene er Dr. Rossella Ciurleo og Dr. Santina Caliri for CNBP, Dr. Lorenzo Gaetani og Prof. Massimiliano Di Filippo for AOPG og Dr. Fabio Moda for FINCB.
• A-synuklein seeding-aktivitet i OM- og hudprøver oppnådd ved hjelp av SAA. Disse analysene vil bli sentralisert ved FINCB og vil bli utført under veiledning av Dr. Fabio Moda og Dr. Chiara Maria Giulia De Luca.
• Plasmanivåer av Aβ42/Aβ40 og p-tau. Disse analysene vil bli sentralisert ved AOPG ved bruk av Lumipulse fullt automatiserte plattform under veiledning av Prof. Lucilla Parnetti og Dr. Lorenzo Gaetani.
• Deteksjon og karakterisering av p-a-syn avleiringer i hudbiopsier, ved bruk av immunhistokjemiske metoder. Dr. Grazia Devigili vil være ansvarlig for denne analysen. De ansvarlige for klinisk datainnsamling i hvert senter er Prof. Lucilla Parnetti og Prof. Massimiliano Di Filippo for AOPG, Dr. Paola Caroppo for FINCB og Dr. Davide Cardile for CNBP. Dataanalysen, for hvert av de tre beskrevne målene, vil i stedet bli koordinert av prof. Lucilla Parnetti med hjelp fra Dr. Santina Caliri og Dr. Davide Cardile ved CNBP.