Mot molekylär profilering av Parkinsons sjukdom i lättillgängliga biologiska matriser

Sammanfattning Parkinsons sjukdom (PD) är den vanligaste neurodegenerativa sjukdomen som involverar funktionsnedsättande motoriska brister. PD är kliniskt heterogen, varför biomarkörer som speglar olika patofysiologiska aspekter behövs för stratifiering och urval av patienter i kliniska prövningar. I detta projekt syftar vi till att mäta biomarkörer associerade med olika molekylära vägar (t.ex. synukleinopati, neuroinflammation, neurodegeneration, amyloidos och tauopati) i olika biologiska prover (cerebrospinalvätska, plasma, olfaktorisk slemhinna och hud) insamlade från en kohort av väldokumenterade patienter med PD, andra neurologiska/neurodegenerativa sjukdomar och kontroller. Bland de övervägda proverna är olfaktorisk slemhinna och plasma lättåtkomliga och därmed lämpliga för upprepad provtagning i kliniska prövningar. De olika biomarkörerna kommer att associeras med motoriska, neuropsykologiska och funktionella poäng för att förstå deras förmåga att förutsäga olika kliniska utfall.

Bakgrund / State of the art Parkinsons sjukdom (PD) är en synukleinopati och den vanligaste neurodegenerativa sjukdomen som involverar funktionsnedsättande motoriska brister. PD är kliniskt heterogen; motorsymptom kan åtföljas av icke-motoriska symptom såsom kognitiv nedsättning. Många molekylära processer kan ligga till grund för den fenotypiska heterogeniteten hos PD, bland vilka synaptisk och axonal degeneration, neuroinflammation och samförekomst av olika proteinopatier är bland de mest karakteriserade och de som har störst chans att på ett tillförlitligt sätt speglas av nuvarande biomarkörer. Faktum är att definitionen av robusta biomarkörer som reflekterar distinkta patofysiologiska vägar i PD kan gynna urvalet av mer homogena patientkohorter i kliniska prövningar, vilket ökar chansen för framgång med en sjukdomsmodifierande terapi som verkar på en eller flera av dessa vägar. Dessutom kan möjligheten att mäta dessa markörer i biologiska matriser lämpliga för upprepad provtagning ge objektiva mått på terapeutiska tillvägagångssätts effektivitet. I detta förslag kommer vi att kombinera expertisen från tre olika italienska medicinska forskningscentra för att verifiera den kliniska nyttan av biomarkörer som speglar olika biologiska vägar, bland vilka synukleinopati, neuroinflammation, neurodegeneration, amyloidos och tauopati, i olika biologiska prover genom att tillämpa immunoassays, proximity extension assays (PEA) och seed amplification assays (SAA).

Beskrivning och fördelning av aktiviteter för varje verksamhetsenhet Forskningsgruppen består av tre verksamhetsenheter (OU): Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) och Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Varje OU kommer att ansvara för urvalet av retrospektiva biologiska prover och för rekrytering av patienter och kontroller under studiens första år. Två lättåtkomliga biologiska prover, dvs. plasma och OM, har/kommer att samlas in med standardiserade procedurer av varje OU från PD-patienter, kontroller (friska individer och patienter med mindre neurologiska störningar, t.ex. huvudvärk, psykiatriska störningar, subjektiva minnesbesvär) och patienter med Alzheimers sjukdom (AD) som andra neurodegenerativa sjukdomskontroller. Hudbiopsier och cerebrospinalvätska (CSF) parade med plasma- och OM-prover samlas in hos PD-patienter och kontroller vid FINCB respektive AOPG. Projektet kommer att omfatta totalt 200 PD-patienter (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 kontroller (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) och 40 AD (AOPG n = 40). Alla PD-patienter som rekryteras kommer att genomgå kognitiv utvärdering inklusive (men inte begränsat till) Mini Mental State Examination (MMSE) och Montreal Cognitive Assessment (MoCA), enligt Movement Disorder Societys kriterier för bedömning av mild kognitiv nedsättning vid PD. Movement Disorders Society Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) kommer att slutföras inklusive UPDRS-III-undersökningen, som kommer att användas för att bestämma motorisk svårighetsgrad i "on"-motoriskt tillstånd. Dessutom kommer motorisk svårighetsgrad av sjukdomsrelaterad funktionsnedsättning att bedömas med hjälp av Hoehn and Yahr-skalan (H&Y). PD-patienter kommer också att genomgå lukttester före OM-provtagning. Kontrollgruppen kommer att bestå av friska volontärer för OM- och plasmaindsamling samt kognitivt oförsvagade individer med subjektiva minnesbesvär eller mindre neurologiska symptom. Ovanstående klinisk information har redan samlats in för den retrospektiva kohorten. AOPG kommer att ta hand om mätningen av plasma amyloid-ß (Aß) 42/Aß40-kvot och fosforylerad vid treonin 181 tau (p-tau) med Lumipulse automatiserad plattform. I en delmängd av 80 PD-patienter och 40 AD har CSF-nivåerna av dessa markörer redan mätts och kommer att användas för att bedöma korrelationen mellan deras CSF- och plasmanivåer. FINCB kommer att utföra SAA-analyser av OM- och hudprover för detektion av benägen för aggregation a-synuklein och immunohistokemisk analys av hudprover för detektion av a-synuklein fosforylerad vid serin 129 (p-a-syn). FINCB har omfattande expertis inom SAA-analys av OM-prover och IHC-analys av hudbiopsier. Här kommer centret att utvidga SAA-analys till hudpunchbiopsier med syftet att jämföra den diagnostiska noggrannheten hos p-a-syn med motsvarande SAA-fynd. I en delmängd av 30 PD och 30 AD/CTRL med parade OM- och CSF-prover kommer CSF SAA-protokollet från Amprion Inc. att tillämpas vid AOPG för att verifiera resultatens överensstämmelse mellan CSF och OM. CNBP kommer specifikt att ansvara för insamling av kliniska och biomarkördata från de tre centren och för att bedöma deras samband. För mätningsenhetlighetens skull kommer PEA-analyserna istället att centraliseras hos Olink (Uppsala, Sverige), där Olink Explore 384 Inflammation och Olink Explore 384 Neurology-paneler kommer att mätas i alla plasmaprover.

Specifika mål och experimentell design

1. Att bestämma ett fingeravtryck av olika kliniska fenotyper av PD genom att kombinera biomarkörer mätta i OM och plasma.
2. Att utvärdera korrelationen mellan kliniska poäng (lukttester, MMSE, MoCA, UPDRS-III) och mätta biomarkörer i plasma och OM.
3. Att validera synukleinopati-, amyloidos-, tauopatimarkörer i parade OM-, plasma-, CSF- och hudprover.

För att uppnå ovan beskrivna mål 1, 2 och 3, är biomarkörerna som kommer att mätas:

• De som mäts i plasma genom att tillämpa Olink Explore 384 Inflammation och Neurology-paneler. De ansvariga för dessa analyser är Dr. Rossella Ciurleo och Dr. Santina Caliri för CNBP, Dr. Lorenzo Gaetani och Prof. Massimiliano Di Filippo för AOPG och Dr. Fabio Moda för FINCB.
• A-synukleins seedningsaktivitet i OM- och hudprover erhållna genom SAA. Dessa analyser kommer att centraliseras vid FINCB och kommer att utföras under överinseende av Dr. Fabio Moda och Dr. Chiara Maria Giulia De Luca.
• Plasmanivåer av Aß42/Aß40 och p-tau. Dessa analyser kommer att centraliseras vid AOPG genom att använda Lumipulse fullt automatiserad plattform under överinseende av Prof. Lucilla Parnetti och Dr. Lorenzo Gaetani.
• Detektion och karakterisering av p-a-syn-avlagringar i hudbiopsier, med immunohistokemiska metoder. Dr. Grazia Devigili kommer att ansvara för denna analys. De ansvariga för klinisk datainsamling i varje centrum är Prof. Lucilla Parnetti och Prof. Massimiliano Di Filippo för AOPG, Dr. Paola Caroppo för FINCB och Dr. Davide Cardile för CNBP. Dataanalysuppgiften, för vart och ett av de tre beskrivna målen, kommer istället att koordineras av prof. Lucilla Parnetti med hjälp av Dr. Santina Caliri och Dr. Davide Cardile vid CNBP.