Para a Caracterização Molecular da Doença de Parkinson em Matrizes Biológicas de Fácil Acesso

Resumo descritivo A doença de Parkinson (DP) é a doença neurodegenerativa mais comum que envolve défices motores incapacitantes. A DP é clinicamente heterogénea, pelo que são necessários biomarcadores que reflitam diferentes aspetos fisiopatológicos para a estratificação e seleção de doentes em ensaios clínicos. Neste projeto, pretendemos medir biomarcadores associados a diferentes vias moleculares (por exemplo, sinucleinopatia, neuroinflamação, neurodegeneração, amiloidose e tauopatia) em diferentes amostras biológicas (líquido cefalorraquidiano, plasma, mucosa olfativa e pele) recolhidas de uma coorte de doentes bem caracterizados afetados por DP, outras doenças neurológicas/neurodegenerativas e controlos. Entre as amostras consideradas, a mucosa olfativa e o plasma são facilmente acessíveis e, portanto, adequados para amostragem repetida em ensaios clínicos. Os diferentes biomarcadores serão associados a pontuações motoras, neuropsicológicas e funcionais para compreender a sua capacidade de prever diferentes resultados clínicos.

Antecedentes / Estado da arte A doença de Parkinson (DP) é uma sinucleinopatia e a doença neurodegenerativa mais comum que envolve défices motores incapacitantes. A DP é clinicamente heterogénea; os sintomas motores podem ser acompanhados por sintomas não motores, como défice cognitivo. Muitos processos moleculares podem estar na base da heterogeneidade fenotípica da DP, entre os quais a degeneração sináptica e axonal, a neuroinflamação e a coocorrência de diferentes proteinopatias estão entre os mais caracterizados e aqueles que têm maior probabilidade de serem refletidos de forma fiável pelos biomarcadores atualmente existentes. De facto, a definição de biomarcadores robustos que reflitam distintas vias fisiopatológicas que ocorrem na DP pode favorecer a seleção de coortes de doentes mais homogéneas em ensaios clínicos, aumentando assim a probabilidade de sucesso de uma terapia modificadora da doença que atue numa ou mais destas vias. Além disso, a possibilidade de medir estes marcadores em matrizes biológicas adequadas para amostragem repetida poderia fornecer medidas objetivas da eficácia da abordagem terapêutica. Nesta proposta, combinaremos a experiência de três diferentes centros italianos de investigação médica para verificar a utilidade clínica de biomarcadores que refletem diferentes vias biológicas, entre as quais sinucleinopatia, neuroinflamação, neurodegeneração, amiloidose e tauopatia, em diferentes amostras biológicas, aplicando ensaios imunoenzimáticos, ensaios de extensão por proximidade (PEA) e ensaios de amplificação de semente (SAA).

Descrição e distribuição das atividades de cada unidade operacional O grupo de investigação é constituído por três unidades operacionais (UO): Azienda Ospedaliera di Perugia (AOPG), Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (FINCB) e Centro Neurolesi Bonino Pulejo (CNBP). Cada UO será responsável pela seleção de amostras biológicas retrospetivas e pelo recrutamento de doentes e controlos no primeiro ano do estudo. Duas amostras biológicas facilmente acessíveis, ou seja, plasma e MO, foram/serão recolhidas utilizando procedimentos padronizados por cada UO de doentes com DP, controlos (indivíduos saudáveis e doentes afetados por perturbações neurológicas menores, por exemplo, cefaleias, perturbações psiquiátricas, queixas de memória subjetivas) e doentes afetados pela doença de Alzheimer (DA) como outros controlos de doenças neurodegenerativas. Biópsias de pele e líquido cefalorraquidiano (LCR) emparelhados com amostras de plasma e MO estão a ser recolhidos em doentes com DP e controlos na FINCB e na AOPG, respetivamente. O projeto incluirá um número total de 200 doentes com DP (AOPG n = 80, FINCB n = 80, CNBP n = 40), 100 controlos (AOPG n = 40, FINCB n = 40, CNBP n = 10) e 40 DA (AOPG n = 40). Todos os doentes com DP que serão recrutados serão submetidos a avaliação cognitiva incluindo (mas não se limitando a) Mini Exame do Estado Mental (MMSE) e Avaliação Cognitiva de Montreal (MoCA), de acordo com os critérios da Movement Disorder Society para avaliação de défice cognitivo ligeiro na DP. A Escala Unificada de Avaliação da Doença de Parkinson da Movement Disorders Society (UPDRS) será preenchida incluindo o exame UPDRS-III, que será utilizado para determinar a gravidade motora no estado motor "on". Além disso, a gravidade motora da incapacidade relacionada com a doença será avaliada por meio da escala de Hoehn e Yahr (H&Y). Os doentes com DP também serão submetidos a testes olfativos antes da amostragem de MO. O grupo de controlo será constituído por voluntários saudáveis para recolha de MO e plasma, bem como por indivíduos cognitivamente não comprometidos afetados por queixas de memória subjetivas ou sintomas neurológicos menores. As informações clínicas acima mencionadas já foram recolhidas para a coorte retrospetiva. A AOPG ficará encarregada da medição da relação plasma amiloide-β (Aβ) 42/Aβ40 e tau fosforilada na treonina 181 (p-tau) com a plataforma automatizada Lumipulse. Num subconjunto de 80 doentes com DP e 40 DA, os níveis de LCR destes marcadores já foram medidos e serão utilizados para avaliar a correlação entre os seus níveis no LCR e no plasma. A FINCB realizará análises SAA de amostras de MO e pele para deteção de a-sinucleína propensa a agregação e análise imuno-histoquímica de amostras de pele para deteção de a-sinucleína fosforilada na serina 129 (p-a-sin). A FINCB tem vasta experiência em análise SAA de amostras de MO e análise IHC de biópsias de pele. Aqui, o centro estenderá a análise SAA a biópsias por punch de pele com o objetivo de comparar a precisão diagnóstica da p-a-sin com os resultados SAA correspondentes. Num subconjunto de 30 DP e 30 DA/CTRL com amostras emparelhadas de MO e LCR, o protocolo SAA de LCR da Amprion Inc. será aplicado na AOPG para verificar a concordância dos resultados entre LCR e MO. O CNBP será especificamente responsável pela recolha de dados clínicos e de biomarcadores dos três centros e pela avaliação das suas relações. Por uma questão de uniformidade das medições, as análises PEA serão, em vez disso, centralizadas na Olink (Uppsala, Suécia), onde os painéis Olink Explore 384 Inflammation e Olink Explore 384 Neurology serão medidos em todas as amostras de plasma.

Objetivos Específicos e Desenho Experimental

1. Determinar uma impressão digital de diferentes fenótipos clínicos de DP combinando biomarcadores medidos na MO e no plasma.
2. Avaliar a correlação entre pontuações clínicas (testes olfativos, MMSE, MoCA, UPDRS-III) e biomarcadores medidos no plasma e na MO.
3. Validar marcadores de sinucleinopatia, amiloidose, tauopatia em amostras emparelhadas de MO, plasma, LCR e pele.

Para cumprir os objetivos 1, 2 e 3 acima descritos, os biomarcadores que serão medidos são:

• Os medidos no plasma aplicando os painéis Olink Explore 384 Inflammation e Neurology; os responsáveis por estas análises são a Dra. Rossella Ciurleo e a Dra. Santina Caliri para o CNBP, o Dr. Lorenzo Gaetani e o Prof. Massimiliano Di Filippo para a AOPG e o Dr. Fabio Moda para a FINCB.
• A atividade de sementeira de a-sinucleína em amostras de MO e pele obtida por meio de SAA. Estas análises serão centralizadas na FINCB e serão realizadas sob a supervisão do Dr. Fabio Moda e da Dra. Chiara Maria Giulia De Luca.
• Níveis plasmáticos de Aβ42/Aβ20 e p-tau. Estas análises serão centralizadas na AOPG utilizando a plataforma totalmente automatizada Lumipulse sob a supervisão da Prof. Lucilla Parnetti e do Dr. Lorenzo Gaetani.
• Deteção e caracterização de depósitos de p-a-syn em biópsias de pele, utilizando métodos imuno-histoquímicos. A Dra. Grazia Devigili será responsável por esta análise. Os responsáveis pela recolha de dados clínicos em cada centro são a Prof. Lucilla Parnetti e o Prof. Massimiliano Di Filippo para a AOPG, a Dra. Paola Caroppo para a FINCB e o Dr. Davide Cardile para o CNBP. A tarefa de análise de dados, para cada um dos três objetivos descritos, será, em vez disso, coordenada pela prof. Lucilla Parnetti com a ajuda da Dra. Santina Caliri e do Dr. Davide Cardile no CNBP.