Profils d'expression génique dans le cancer du poumon non à petites cellules métastatique du SNC

Les métastases cérébrales surviennent chez 30 à 50 % des patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire (LAC) et confèrent un pronostic et une qualité de vie moins bons. Une meilleure sélection des patients à risque grâce à un biomarqueur plus précis pourrait améliorer le bénéfice des thérapies prophylactiques. Le but de cette étude prospective était de déterminer un profil d'expression génique de la tumeur primaire associée à des métastases cérébrales (BM) et d'évaluer la survie globale (OS) chez les patients atteints de LAC avancé.

Introduction.Le cancer du poumon est la première cause de décès par cancer dans le monde. Chaque année, 85 % des patients reçoivent un diagnostic de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Malgré les efforts, les innovations et les progrès dans le diagnostic et le traitement de ces patients, la survie globale (SG) à 5 ans du diagnostic n'est que de 15 %. Le système nerveux central (SNC) est un site dévastateur et fréquent de développement de métastases dans le NSCLC. L'incidence rapportée de métastases du SNC chez les patients atteints de NSCLC est de 54 % avec une SG < 1 an après le diagnostic. L'âge, le stade clinique, le sexe et la période de traitement initiale sont quelques-uns des facteurs liés au développement des métastases du SNC rapportés chez les patients atteints de NSCLC. Nous avons récemment décrit que des taux sériques élevés d'antigène carcino-embryonnaire (CEA) (> 40 ng / dL) au moment du diagnostic et du type histologique d'adénocarcinome sont indépendamment associés à un risque plus élevé en cas de développement de métastases cérébrales. Cependant, en raison de leur manque de spécificité de tous ces facteurs rapportés, nous sommes tenus de détecter des biomarqueurs pour prédire les métastases cérébrales chez les patients atteints de NSCLC dans le but d'empêcher leur développement. Le processus de métastase est complexe, il implique des étapes moléculaires bien définies, comme l'invasion, l'intravasation vasculaire, l'implantation et la croissance au niveau du nouvel organe spécifique. Une motilité plus élevée, une capacité de dégradation de la matrice extracellulaire, une évasion du système immunitaire et une adhésion au nouvel organe spécifique sont quelques-unes des caractéristiques des cellules tumorales nécessaires pour métastaser. En particulier, les événements moléculaires pour le développement de métastases cérébrales à partir du NSCLC primaire, même s'ils ne sont pas du tout décrits, sont actuellement bien compris. Les microréseaux d'expression génique permettent d'analyser simultanément les changements d'expression de milliers de gènes, en distinguant l'expression altérée des gènes des cellules néoplasiques du tissu normal. L'identification de modèles biologiques, de cibles moléculaires pharmacologiques et de biomarqueurs pour le pronostic et l'évaluation de la réponse thérapeutique, et même une classification plus spécifique des néoplasies sont quelques-uns des résultats des études sur les microréseaux d'expression génique dans le cancer hématologique, du sein et NSCLC. La détermination des changements transcriptionnels de la fumée de tabac dans les oncogènes et les anticogènes a été déterminée par les données d'utilisation des microréseaux. Un profil d'expression génique de 20 gènes différencie le tissu pulmonaire sain et le cancer du poumon avec une spécificité plus élevée que l'évaluation histopathologique. De plus, des études sur micropuces d'expression génique ont été développées pour prédire la survie et la récidive aux stades précoces du NSCLC afin d'identifier les patients qui pourraient bénéficier d'un traitement adjuvant, avec des résultats prometteurs. L'objectif de cette étude était d'identifier un profil d'expression génique à partir du primaire adénocarcinome pulmonaire lié à une métastase cérébrale, et d'évaluer de manière prospective leur signification pronostique sur la survie chez les patients atteints d'une maladie avancée. Conception expérimentale Ces études ont utilisé des cohortes cliniques, longitudinales, prospectives, observationnelles et analytiques avec la sélection d'un type non probabiliste échantillon.De manière prospective, de janvier 2009 à juin 2011, les patients admis dans notre Institut confirmés histologiquement confirmés de stade IIIb et IV de LAC étaient éligibles à l'inclusion dans l'étude. Les variables cliniques analysées comprenaient les antécédents de tabagisme, le sexe, l'âge, l'état général et le développement de métastases cérébrales. Une biopsie au trocart tumoral primaire a été réalisée avant tout traitement et congelée instantanément. Un seul pathologiste a évalué toutes les tumeurs. Une chimiothérapie standard à base de platine a été utilisée pour tous les patients. Tous les patients ont été soumis à une imagerie par résonance magnétique (MR) pour mettre en évidence la présence ou l'absence de métastases cérébrales (BM). Au cours du suivi, nous avons réalisé à cet effet une tomodensitométrie (TDM) du tronc cérébral. Une analyse statistique préliminaire a été effectuée à l'aide du test t de Student, du test U de Mann-Whitney, du χ2 ou du test exact de Fisher. Une fois l'étude terminée, nous procéderons à une analyse multivariée de régression logistique. Le temps de survie global sera analysé avec la technique de Kaplan-Meier, et les comparaisons entre les groupes seront effectuées avec le test du log-rank. Les caractéristiques à haut risque telles que le sexe, l'histologie et l'âge liés à une plus grande fréquence de développement de métastases au SNC ont été analysées. L'étude a été réalisée selon les principes des essais cliniques et acceptée par les comités bioéthiques et scientifiques de l'INCan (numéros de référence INCAN/CC/ 067/08). Un accord de collaboration a été signé avec l'INMEGEN et a été approuvé au sein du Fonds Sectoriel de Recherche en Santé (FSIS) CONACyT-México (SALUD-2009-01-115552).

La sélection pour obtenir des biopsies tumorales dépendait des caractéristiques du patient et de la tumeur. La biopsie peut être réalisée au moyen d'une aiguille tru-cut guidée par tomodensitométrie, d'une thoracoscopie ouverte ou d'une bronchoscopie avec fibre optique. Chaque échantillon de tumeur a été divisé en deux ; un échantillon a été analysé par le service de pathologie de l'INCan (par un seul observateur aveugle aux variables cliniques) pour leur diagnostic clinique histologique et la quantification de la cellularité néoplasique, et la moitié restante a été immédiatement stockée à -80°C jusqu'au traitement pour l'extraction de l'ARN.ARN Extraction : L'ARN a été extrait de biopsies tumorales congelées, pesées et cryofracturées dans de l'azote liquide. L'extraction et la purification de l'ARN total du tissu (jusqu'à 5 mg de tissu) ont été effectuées à l'aide du kit RNeasy Micro (QIAGEN, Allemagne) (cat. 217084). L'ARN a été analysé à l'aide de la puce Agilent 6000 (Agilent Technologies, Santa Clara, C.A.). La qualité de l'ARN consistait en l'obtention d'un numéro d'intégrité de l'ARN (RIN)> 8. Les échantillons d'ARN ont été choisis pour l'analyse par microréseau lorsque la qualité et la concentration ont été obtenues à cette fin. Microarray Expression : Nous utilisons une plate-forme Affymetrix, qui consiste en un microarray d'oligonucléotides synthétisé in situ. La GeneChip® que nous utilisons est le Human Gene 1.0 ST Array, qui permet d'analyser l'expression de 28 869 gènes différents (chaque transcrit est représenté par 26 sondes dispersées sur toute sa longueur, présentes dans le génome humain, qui couvre 99% de la séquences présentes dans la banque de données RefSeq de la GenBank. Le protocole d'étiquetage cible à deux cycles est suivi comme suggéré par le fabricant et décrit succinctement comme suit et illustré graphiquement dans la figure à la fin de cette section Matériels et méthodes : L'ARN total (100 ng/uL) est rétro-transcrit à l'aide de T7- Amorces oligo(dT) Promoter dans la réaction de synthèse de la première chaîne d'ADN complémentaire (ADNc). Après traitement à la RNAase H, la deuxième chaîne d'ADNc est synthétisée, qui servira de matrice dans la réaction de transcription in vitro (TVI). La première réaction TVI est réalisée avec de l'ARN polymérase T7 et des ribonucléotides non marqués pour l'amplification d'ARN complémentaire (ARNc). Ces ARNc sont rétro-transcrits dans l'étape de synthèse de la première chaîne d'ADNc du deuxième cycle à l'aide d'amorces aléatoires. Par la suite, des amorces T7-Oligo(dT)-Promoter sont utilisées pour la synthèse de la deuxième chaîne d'ADNc, générant la matrice d'ADNc à double hélice qui contient la séquence promotrice T7. Cet ADNc est amplifié et marqué dans une deuxième réaction TVI en utilisant l'ADN polymérase T7 et un mélange de ribonucléotides/analogue de nucléotide biotinylé. Ces ADNc biotinylés cibles sont nettoyés, fragmentés et hybrides aux puces d'expression GeneChip®. Après hybridation, un marquage fluorescent a été réalisé avec un système amplificateur streptavidine-phycoérythrine et anticorps anti-streptavidine biotinylé. La fluorescence est détectée à l'aide d'un scanner laser haute résolution.Lecture et analyse des microréseaux d'expression : nous utiliserons le logiciel Expression Console d'Affymetrix pour évaluer la qualité des microréseaux et corrigerons le signal de fond avec des méthodes standard [49,50]. Pour la normalisation du niveau d'intensité du signal, nous utiliserons des méthodes "non supervisées", qui utilisent les données de tous les microréseaux de l'expérience ; cela nous permettra de les rendre comparables entre eux, car ce qu'un test microarray évalue, c'est l'expression des gènes au moyen des intensités de fluorescence ; il est donc important d'établir des seuils à partir desquels nous pouvons considérer la sous- ou la surexpression. Une fois les données normalisées, l'étape finale consiste à reprendre les valeurs de toutes les sondes qui existent pour chaque gène dans le microréseau en une seule valeur, qui est le niveau d'expression du gène. Pour la détection des gènes différentiellement exprimés, nous construirons un modèle linéaire qui inclut simultanément tous les microréseaux de l'expérience ; de cette manière, nous pourrons analyser les contrastes entre le groupe A (patients avec métastases au SNC au cours de la période de suivi) et le groupe B (patients sans métastases au SNC au cours de la même période). En tant que contrôle interne, nous prouverons l'expression différentielle de certains gènes par RT-PCR en temps réel. Les résultats seront représentés dans des blocs de cartes thermiques et dans des tableaux, dans lesquels les gènes les plus actifs sont répertoriés avec leur description fonctionnelle. Pour la validation du profil de risque, nous appliquerons la méthode de validation croisée leave-one-out et postulerons une deuxième cohorte pour cet objectif.