CNS 转移性非小细胞肺癌的基因表达谱

脑转移发生在 30-50% 的肺腺癌 (LAC) 患者中，并导致更差的预后和生活质量。 通过更准确的生物标志物更好地选择高危患者可以提高预防性治疗的益处。 这项前瞻性研究的目的是确定与脑转移 (BM) 相关的原发性肿瘤的基因表达谱，并评估晚期 LAC 患者的总生存期 (OS)。

简介：肺癌是世界上癌症死亡的首位原因。 每年有 85% 的患者被诊断出患有非小细胞肺癌 (NSCLC)。 尽管在这些患者的诊断和治疗方面做出了努力、创新和进步，但诊断后 5 年的总生存率 (OS) 仅为 15%。 中枢神经系统 (CNS) 是 NSCLC 中转移发展的破坏性和频繁发生的部位。 据报道，NSCLC 患者的 CNS 转移发生率为 54%，诊断后 OS 小于 1 年。 年龄、临床分期、性别和初始治疗期是一些已报道的与 NSCLC 患者 CNS 转移发展相关的因素。 我们最近描述了诊断时的高癌胚抗原 (CEA) 血清水平 (>40 ng/dL) 和腺癌组织学类型与发生脑转移的高风险独立相关。 然而，由于所有这些报告的因素都缺乏特异性，我们需要检测生物标志物来预测 NSCLC 患者的脑转移，以防止其发展。转移过程很复杂，涉及明确的分子打印步骤，如侵袭、血管内渗、在新的特定器官的着床和生长。 更高的运动性、细胞外基质降解的能力、免疫系统逃避和在新的特定器官的粘附是转移所需的一些肿瘤细胞特征。 特别是，即使没有任何描述，原发性 NSCLC 脑转移发展的分子事件目前也已得到充分了解。 基因表达微阵列允许同时分析数千个基因的表达变化，将肿瘤细胞基因的表达改变与正常组织区分开来。 血液学、乳腺癌和 NSCLC 基因表达微阵列研究的部分结果包括生物学模式、药理学分子靶标和用于预后和治疗反应评估的生物标志物的鉴定，甚至更具体的肿瘤分类。 已通过使用微阵列数据确定致癌基因和抑癌基因中烟草烟雾转录变化的测定。 20 个基因的基因表达谱区分健康肺组织和肺癌的特异性高于组织病理学评估。 此外，基因表达微阵列研究已被开发用于预测早期 NSCLC 阶段的生存和复发，以识别可能受益于辅助治疗的患者，并取得了有希望的结果。与脑转移相关的肺腺癌，并以前瞻性方式评估它们对晚期疾病患者生存的预后意义。实验设计样本。以前瞻性的方式，从 2009 年 1 月到 2011 年 6 月，我们研究所收治的经组织学证实的 LAC IIIb 期和 IV 期患者符合纳入研究的条件。 分析的临床变量包括吸烟史、性别、年龄、一般情况和脑转移发展。 在任何治疗和快速冷冻之前进行原发性肿瘤核心活检。 一位病理学家评估了所有肿瘤。 所有患者均采用标准的铂类化疗。 所有患者均接受磁共振成像 (RM) 以证明是否存在脑转移 (BM)。 在随访期间，我们为此进行了脑干计算机断层扫描 (CT)。 使用 Student t、Mann-Whitney U、χ2 或 Fisher 精确检验进行初步统计分析。 一旦研究结束，我们将进行逻辑回归多元分析。 全球生存时间将使用 Kaplan-Meier 技术进行分析，组间比较将使用对数秩检验进行。 分析了性别、组织学和年龄等与中枢神经系统转移发生频率相关的高风险特征。该研究根据临床试验原则进行，并被 INCan 生物伦理和科学委员会接受（参考编号 INCAN/CC/ 067/08）。 与 INMEGEN 签署了合作协议，并在健康研究部门基金 (FSIS) CONACyT-México (SALUD-2009-01-115552) 内获得批准。

获得肿瘤活检的选择取决于患者和肿瘤的特征。 活组织检查可通过CT引导的切开针、开腹胸腔镜或光纤支气管镜进行。 每个肿瘤样本被分成两份；一个样本由 INCan 病理学服务中心（由对临床变量不知情的唯一观察员）进行分析，以进行组织学临床诊断和肿瘤细胞数量的量化，其余一半立即储存在 -80°C，直到进行 RNA 提取处理。 RNA提取：从冷冻肿瘤活检组织中提取 RNA，称重并在液氮中冷冻断裂。 使用 RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Germany) (cat. 217084）。 使用 Agilent 6000 芯片（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）分析 RNA。 RNA 质量包括获得 RNA 完整性数 (RIN) > 8。当为此目的获得质量和浓度时，选择 RNA 样品用于微阵列分析。 微阵列表达：我们正在使用 Affymetrix 平台，该平台由原位合成的寡核苷酸微阵列组成。 我们使用的 GeneChip® 是人类基因 1.0 ST 阵列，它允许分析 28,869 个不同基因的表达（每个转录本由 26 个分散的探针沿其整个长度表示，存在于人类基因组中，覆盖了 99% GenBank 的 RefSeq 数据库中存在的序列。 按照制造商的建议遵循双循环目标标记方案，并简要描述如下，并在本材料和方法部分末尾的图中以图形方式显示：使用 T7- 逆转录总 RNA (100 ng/uL)第一互补 DNA 链 (cDNA) 合成反应中的 Oligo(dT) 启动子引物。 用 RNAase H 处理后，合成第二条 cDNA 链，它将作为体外转录反应 (TVI) 的模板。 第一个 TVI 反应是用 T7 聚合酶 RNA 和未标记的核糖核苷酸进行的，用于扩增互补 RNA (cRNA)。 这些 cRNA 在第二个循环的第一条 cDNA 链的合成步骤中使用随机引物进行逆转录。 随后，使用 T7-Oligo(dT)-启动子引物合成第二条 cDNA 链，生成包含启动子 T7 序列的双螺旋 cDNA 模板。 该 cDNA 在第二个 TVI 反应中使用 T7 聚合酶 DNA 和核糖核苷酸/生物素化核苷酸类似物的混合物进行扩增和标记。 这些目标生物素化的 cDNA 被清洗、片段化并与 GeneChip® 表达微阵列杂交。 杂交后，用链霉亲和素-藻红蛋白和生物素化抗链霉亲和素抗体放大器系统进行荧光标记。 使用高分辨率激光扫描仪检测荧光。表达微阵列的读取和分析：我们将利用 Affymetrix 软件的表达控制台来评估微阵列的质量，并将使用标准方法校正背景信号 [49,50]。 对于信号强度水平归一化，我们将采用“非监督”方法，该方法使用所有实验微阵列的数据；这将使我们能够在它们之间进行比较，因为微阵列分析评估的是通过荧光强度的基因表达；因此，重要的是建立我们可以考虑表达不足或过度表达的截止点。 一旦数据被归一化，最后阶段是将微阵列中每个基因存在的所有探针的值恢复为唯一值，即基因的表达水平。 为了检测差异表达的基因，我们将构建一个同时包含所有实验微阵列的线性模型；通过这种方式，我们将能够分析 A 组（随访期间有 CNS 转移的患者）和 B 组（同期没有转移到 CNS 的患者）之间的对比。 作为内参，我们将通过RT-PCR实时验证部分基因的差异表达。 结果将以热图块和表格的形式表示，其中列出了最活跃的基因及其功能描述。 对于风险概况验证，我们将执行留一法交叉验证方法，并将为此目标假设第二个队列。