Genexpressieprofielen bij CZS-gemetastaseerde niet-kleincellige longkanker

Hersenmetastasen komen voor bij 30-50% van de patiënten met longadenocarcinoom (LAC) en geven een slechtere prognose en kwaliteit van leven. Een betere selectie van risicopatiënten door middel van een nauwkeurigere biomarker zou het voordeel van profylactische therapieën kunnen verbeteren. Het doel van deze prospectieve studie was het bepalen van een genexpressieprofiel van primaire tumor geassocieerd met hersenmetastase (BM) en het evalueren van de totale overleving (OS) bij patiënten met gevorderde LAC.

Inleiding.Longkanker is de eerste doodsoorzaak door kanker ter wereld. Vijfentachtig procent van de patiënten wordt jaarlijks gediagnosticeerd met niet-kleincellige longkanker (NSCLC). Ondanks inspanningen, innovaties en vooruitgang in de diagnose en behandeling van deze patiënten, is de algehele overleving (OS) na 5 jaar diagnose slechts 15%. Het centrale zenuwstelsel (CZS) is een verwoestende en frequente plaats van ontwikkeling van metastasen bij NSCLC. De gerapporteerde incidentie van CZS-metastasen bij patiënten met NSCLC is 54% met een OS van <1 jaar na diagnose. Leeftijd, klinisch stadium, geslacht en initiële behandelingsperiode zijn enkele van de gerapporteerde factoren met betrekking tot CZS-metastaseontwikkeling bij patiënten met NSCLC. We hebben onlangs beschreven dat hoge carcino-embryonale antigeen (CEA) serumspiegels (> 40 ng / dL) bij diagnose en adenocarcinoom histologisch type onafhankelijk geassocieerd zijn met een hoger risico als hersenmetastasen zich ontwikkelen. Vanwege hun gebrek aan specificiteit van al deze gerapporteerde factoren, zijn we echter verplicht om biomarkers te detecteren om hersenmetastasen te voorspellen bij patiënten met NSCLC met als doel hun ontwikkeling te voorkomen. Het metastaseproces is complex, het omvat goed gedefinieerde moleculair afgedrukte stappen, zoals invasie, vasculaire intravasatie, implantatie en groei van het nieuwe specifieke orgaan. Hogere beweeglijkheid, capaciteit voor afbraak van extracellulaire matrix, ontduiking van het immuunsysteem en adhesie aan het nieuwe specifieke orgaan zijn enkele van de tumorcelkenmerken die nodig zijn om te metastaseren. Met name de moleculaire gebeurtenissen voor de ontwikkeling van hersenmetastasen van primaire NSCLC, zelfs als deze helemaal niet zijn beschreven, worden momenteel goed begrepen. Met microarray voor genexpressie kunnen de expressieveranderingen van duizenden genen tegelijkertijd worden geanalyseerd, waardoor de veranderde expressie van neoplastische celgenen kan worden onderscheiden van normaal weefsel. Identificatie van biologische patronen, farmacologische moleculaire doelen en biomarkers voor prognose en evaluatie voor therapeutische respons, en zelfs een meer specifieke classificatie van neoplasie zijn enkele van de resultaten van genexpressie microarray-onderzoeken bij hematologische, borst- en NSCLC-kanker. Bepaling van transcriptionele veranderingen in tabaksrook in oncogenen en anticogenen was bepaald door het gebruik van microarray-gegevens. Een genexpressieprofiel van 20 genen onderscheidt gezond longweefsel en longkanker met een hogere specificiteit dan histopathologische evaluatie. Bovendien waren microarray-onderzoeken naar genexpressie ontwikkeld voor het voorspellen van overleving en recidief in vroege NSCLC-stadia voor de identificatie van patiënten die baat zouden kunnen hebben bij adjuvante therapie, met veelbelovend resultaat. Het doel van deze studie was om een ​​genexpressieprofiel te identificeren van primaire longadenocarcinoom gerelateerd aan hersenmetastase, en om op een prospectieve manier hun prognostische betekenis voor de overleving van patiënten met gevorderde ziekte te evalueren. Experimenteel ontwerp Deze studie gebruikte klinische, longitudinale, prospectieve, observationele en analytische cohorten met de selectie van een niet-probabalistisch type steekproef. Op een prospectieve manier, van januari 2009 tot juni 2011, bevestigden patiënten die in ons instituut waren opgenomen dat histologisch bevestigd stadium IIIb en IV van LAC in aanmerking kwamen voor opname in de studie. Geanalyseerde klinische variabelen omvatten rookgeschiedenis, geslacht, leeftijd, algemene toestand en ontwikkeling van hersenmetastasen. Primaire tumorkernbiopsie werd voorafgaand aan elke behandeling uitgevoerd en snel ingevroren. Een enkele patholoog evalueerde alle tumoren. Bij alle patiënten werd standaard op platina gebaseerde chemotherapie toegepast. Alle patiënten werden onderworpen aan Magnetic Resonance Imaging (RM) om de aan- of afwezigheid van hersenmetastasen (BM) aan te tonen. Tijdens de follow-up hebben we hiervoor een computertomografie (CT) van de hersenstam uitgevoerd. Voorlopige statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de Student t, de Mann-Whitney U, de χ2 of de Fisher exact-test. Zodra de studie is afgelopen, voeren we logistische-regressie multivariate analyse uit. De globale overlevingstijd zal worden geanalyseerd met de Kaplan-Meier-techniek, en vergelijkingen tussen groepen zullen worden uitgevoerd met de log-rank-test. Kenmerken met een hoog risico, zoals geslacht, histologie en leeftijd gerelateerd aan een hogere frequentie van ontwikkeling van metastasen naar het CZS, werden geanalyseerd. 067/08). Er werd een samenwerkingsovereenkomst getekend met INMEGEN en goedgekeurd binnen het Health Research Sectorial Fund (FSIS) CONACyT-México (SALUD-2009-01-115552).

Selectie voor het verkrijgen van tumorbiopten was afhankelijk van de kenmerken van de patiënt en van de tumor. De biopsie kan worden genomen door middel van CT-geleide tru-cut-naald, open thoracoscopie of bronchoscopie met optische vezels. Elk tumormonster werd in tweeën gedeeld; één monster werd geanalyseerd door de INCan Pathology Service (door een enkele waarnemer die blind was voor de klinische variabelen) voor hun histologische klinische diagnose en kwantificering van neoplastische cellulariteit, en de resterende helft werd onmiddellijk bewaard bij -80°C tot verwerking voor RNA-extractie.RNA Extractie: RNA werd geëxtraheerd uit bevroren tumorbiopten, gewogen en ingevroren in vloeibare stikstof. Extractie en zuivering van totaal RNA uit weefsel (tot 5 mg weefsel) procedure werd uitgevoerd met behulp van RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Duitsland) (cat. 217084). RNA werd geanalyseerd met behulp van de Agilent 6000 Chip (Agilent Technologies, Santa Clara, C.A.). RNA-kwaliteit bestond uit het verkrijgen van RNA Integrity Number (RIN)> 8. RNA-monsters werden gekozen voor microarray-analyse wanneer kwaliteit en concentratie voor dit doel werden verkregen. Microarray-expressie: we gebruiken een Affymetrix-platform, dat bestaat uit een in situ gesynthetiseerde oligonucleotide-microarray. De GeneChip® die we gebruiken is de Human Gene 1.0 ST Array, waarmee de expressie van 28.869 verschillende genen kan worden geanalyseerd (elk transcript wordt vertegenwoordigd door 26 verspreide probes over de gehele lengte, aanwezig in het menselijk genoom, dat 99% van de sequenties die aanwezig zijn in de RefSeq-databank van de GenBank. Het Two-Cycle Target Labeling-protocol wordt gevolgd zoals voorgesteld door de fabrikant en beknopt als volgt beschreven en grafisch weergegeven in de afbeelding aan het einde van deze sectie Materialen en methoden: Totaal RNA (100 ng/uL) wordt retro-getranscribeerd met behulp van T7- Oligo(dT) Promotorprimers in de synthesereactie van de eerste complementaire DNA-keten (cDNA). Na behandeling met RNAase H wordt de tweede cDNA-keten gesynthetiseerd, die zal dienen als matrijs in de Transcriptiereactie in vitro (TVI). De eerste TVI-reactie wordt uitgevoerd met T7-polymerase-RNA en ongemarkeerde ribonucleotiden voor de amplificatie van complementair RNA (cRNA). Deze cRNA's worden retro-getranscribeerd in de synthesestap van de eerste cDNA-keten van de tweede cyclus met behulp van willekeurige primers. Vervolgens worden T7-Oligo(dT)-Promotor-primers gebruikt voor de synthese van de tweede keten van cDNA, waarbij de dubbele-helix-cDNA-matrijs wordt gegenereerd die de promotor-T7-sequentie bevat. Dit cDNA wordt geamplificeerd en gemarkeerd in een tweede TVI-reactie met behulp van het T7-polymerase-DNA en een mengsel van ribonucleotiden/gebiotinyleerd nucleotide-analogon. Deze gebiotinyleerde doelwit-cDNA's worden opgeschoond, gefragmenteerd en gehybridiseerd met de GeneChip®-expressie-microarrays. Na hybridisatie werd fluorescerende markering uitgevoerd met een streptavidine-fycoerythrine en gebiotinyleerd anti-streptavidine antilichaamversterkersysteem. Fluorescentie wordt gedetecteerd met een laserscanner met hoge resolutie. Uitlezen en analyseren van Expression Microarrays: We zullen de Expression Console van Affymetrix-software gebruiken om de kwaliteit van de microarrays te evalueren en zullen het achtergrondsignaal corrigeren met standaardmethoden [49,50]. Voor normalisatie op signaalintensiteitsniveau zullen we "niet-gesuperviseerde" methoden gebruiken, die de gegevens van alle microarrays van het experiment gebruiken; dit stelt ons in staat om deze onderling vergelijkbaar te maken, want wat een microarray-assay evalueert, is genexpressie door middel van fluorescentie-intensiteiten; het is dus belangrijk om afkappunten vast te stellen van waaruit we onder- of overexpressie kunnen overwegen. Zodra de gegevens zijn genormaliseerd, is de laatste fase het hervatten van de waarden van alle probes die voor elk gen in de microarray bestaan ​​in een enkele waarde, namelijk het expressieniveau van het gen. Voor de detectie van differentieel tot expressie gebrachte genen zullen we een lineair model construeren dat alle microarrays van het experiment tegelijkertijd omvat; op deze manier kunnen we contrasten analyseren tussen groep A (patiënten met uitzaaiingen naar het CZS tijdens de follow-upperiode) en groep B (patiënten zonder uitzaaiingen naar het CZS in dezelfde periode). Als interne controle zullen we de differentiële expressie van sommige genen bewijzen door middel van RT-PCR in real time. De resultaten worden weergegeven in blokken van heatmaps en in tabellen, waarin de meest actieve genen worden vermeld, samen met hun functionele beschrijving. Voor de validatie van het risicoprofiel zullen we een 'leave-one-out'-kruisvalidatiemethode uitvoeren en een tweede cohort postuleren voor deze doelstelling.