Gen-expressionsprofiler i CNS-metastaserande icke-småcellig lungcancer

Hjärnmetastaser förekommer hos 30-50 % av patienterna med lungadenokarcinom (LAC) och ger sämre prognos och livskvalitet. Ett bättre urval av riskpatienter genom en mer exakt biomarkör skulle kunna förbättra fördelarna med profylaktiska terapier. Syftet med denna prospektiva studie var att fastställa en genuttrycksprofil för primärtumör associerad med hjärnmetastas (BM) och att utvärdera den totala överlevnaden (OS) hos patienter med avancerad LAC.

Inledning.Lungcancer är den första orsaken till cancerdöd i världen. Åttiofem procent av patienterna diagnostiseras årligen med icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Trots ansträngningar, innovationer och framsteg i diagnos och behandling av dessa patienter är den totala överlevnaden (OS) vid 5 års diagnos bara 15 %. Det centrala nervsystemet (CNS) är en förödande och frekvent plats för metastasutveckling vid NSCLC. Den rapporterade incidensen av CNS-metastaser hos patienter med NSCLC är 54 % med ett OS på <1 år efter diagnos. Ålder, kliniskt stadium, kön och initial behandlingsperiod är några av de rapporterade med CNS-metastasutvecklingsrelaterade faktorer hos patienter med NSCLC. Vi beskrev nyligen att höga serumnivåer av karcino-embryonalt antigen (CEA) (> 40 ng/dL) vid diagnos och histologisk typ av adenocarcinom är oberoende associerade med högre risk om hjärnmetastasutveckling. Men på grund av deras bristande specificitet för alla dessa rapporterade faktorer, måste vi upptäcka biomarkörer för att förutsäga hjärnmetastaser hos patienter med NSCLC med målet att förhindra deras utveckling. Metastaseringsprocessen är komplex och involverar väldefinierade molekylärtryckta steg, som invasion, vaskulär intravasation, implantation och tillväxt vid det nya specifika organet. Högre motilitet, kapacitet för extracellulär matrisnedbrytning, undanflykt från immunsystemet och vidhäftning vid det nya specifika organet är några av de tumörcellsegenskaper som krävs för att metastasera. I synnerhet är molekylära händelser för utveckling av hjärnmetastaser från primär NSCLC, även om de inte alls beskrivs, för närvarande väl förstått. Genuttrycksmikroarray gör det möjligt att analysera uttrycksförändringar av tusentals gener samtidigt, vilket särskiljer det förändrade uttrycket av neoplastiska cellgener från normal vävnad. Identifiering av biologiska mönster, farmakologiska molekylära mål och biomarkörer för prognos och utvärdering av terapeutiskt svar, och även en mer specifik neoplasiklassificering är några av resultaten av mikroarraystudier med genuttryck i hematologisk cancer, bröstcancer och NSCLC. Bestämning av transkriptionella förändringar av tobaksrök i onkogener och antionkogener hade bestämts med hjälp av mikroarraydata. En genuttrycksprofil på 20 gener skiljer hälsolungvävnad och lungcancer åt med högre specificitet än histopatologisk utvärdering. Dessutom hade mikroarraystudier med genuttryck utvecklats för att förutsäga överlevnad och återfall i tidiga NSCLC-stadier för identifiering av patienter som kunde ha nytta av adjuvant terapi, med lovande resultat. Syftet med denna studie var att identifiera en genuttrycksprofil från primär lungadenokarcinom relaterat till hjärnmetastaser, och att på ett prospektivt sätt utvärdera deras prognostiska betydelse för överlevnad hos patienter med avancerad sjukdom. Experimentell design Denna studie använde kliniska, longitudinella, prospektiva, observations- och analytiska kohorter med val av en icke-probabalistisk typ På ett prospektivt sätt, från januari 2009 till juni 2011, bekräftade patienter som tagits in på vårt institut histologiskt bekräftade stadium IIIb och IV av LAC var berättigade till studieinkludering. Analyserade kliniska variabler omfattade rökhistoria, kön, ålder, allmäntillstånd och utveckling av hjärnmetastaser. Primär tumörkärnbiopsi utfördes före någon behandling och snabbfrystes. En enda patolog utvärderade alla tumörer. Standard platinabaserad kemoterapi användes för alla patienter. Alla patienter underkastades magnetisk resonanstomografi (RM) för att bevisa närvaron eller frånvaron av hjärnmetastaser (BM). Under uppföljningen genomförde vi datortomografi (CT) av hjärnstammen för detta ändamål. Preliminär statistisk analys utfördes med användning av Student t, Mann-Whitney U, χ2 eller Fishers exakta test. När studien avslutas kommer vi att genomföra multivariatanalys med logistisk regression. Global överlevnadstid kommer att analyseras med Kaplan-Meier-tekniken och jämförelser mellan grupper kommer att utföras med log-rank test. Högriskegenskaper som kön, histologi och ålder relaterade med högre frekvens av utveckling av metastaser till CNS analyserades. Studien utfördes enligt principerna för ClinicalTrials och accepterades av INCan Bioethical and Scientific Committees (referensnummer INCAN/CC/ 067/08). Ett samarbetsavtal undertecknades med INMEGEN och godkändes inom Health Research Sector Fund (FSIS) CONACyT-México (SALUD-2009-01-115552).

Urval för att erhålla tumörbiopsier berodde på egenskaperna hos patienten och tumören. Biopsi kan tas med hjälp av CT-styrd tru-cut nål, öppen torakoskopi eller bronkoskopi med optisk fiber. Varje tumörprov delades upp i två; ett prov analyserades av INCan Pathology Service (av en enda observatör som var blind för de kliniska variablerna) för deras histologiska kliniska diagnos och kvantifiering av neoplastisk cellularitet, och den återstående hälften förvarades omedelbart vid -80°C tills bearbetning för RNA-extraktion.RNA Extraktion: RNA extraherades från frusna tumörbiopsier, vägdes och kryofrakturerades i flytande kväve. Extraktion och rening av totalt RNA från vävnad (upp till 5 mg vävnad) procedur gjordes med användning av RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Tyskland) (kat. 217084). RNA analyserades med användning av Agilent 6000 Chip (Agilent Technologies, Santa Clara, C.A.). RNA-kvaliteten bestod av erhållandet av RNA-integritetsnummer (RIN) > 8. RNA-prover valdes för mikroarrayanalys när kvalitet och koncentration erhölls för detta ändamål. Microarray Expression: Vi använder en Affymetrix-plattform, som består av en in situ syntetiserad oligonukleotid-mikroarray. GeneChip® som vi använder är Human Gene 1.0 ST Array, som gör det möjligt att analysera uttrycket av 28 869 olika gener (varje transkript representeras av 26 spridda prober längs hela sin längd, närvarande i det mänskliga genomet, som täcker 99 % av sekvenser som finns i RefSeq-databanken i GenBank. Målmärkningsprotokollet med två cykler följs som föreslagits av tillverkaren och beskrivs kortfattat enligt följande och visas grafiskt i figuren i slutet av avsnittet Material och metoder: Totalt RNA (100 ng/uL) retrotranskriberas med T7- Oligo(dT)-promotorprimrar i syntesreaktionen av den första komplementära DNA-kedjan (cDNA). Efter behandling med RNAas H syntetiseras den andra cDNA-kedjan, som kommer att fungera som mall i transkriptionsreaktionen in vitro (TVI). Den första TVI-reaktionen utförs med T7-polymeras-RNA och omärkta ribonukleotider för amplifiering av komplementärt RNA (cRNA). Dessa cRNA:n retrotranskriberas i syntessteget av den första cDNA-kedjan i den andra cykeln med användning av slumpmässiga primrar. Därefter används T7-Oligo(dT)-promotorprimrar för syntesen av den andra kedjan av cDNA, vilket genererar dubbelhelix-cDNA-mallen som innehåller promotor-T7-sekvensen. Detta cDNA amplifieras och markeras i en andra TVI-reaktion med användning av T7-polymeras-DNA och en blandning av ribonukleotider/biotinylerad nukleotidanalog. Dessa målbiotinylerade cDNA rengörs, fragmenteras och hybridiseras till GeneChip®-expressionsmikroarrayerna. Efter hybridisering utfördes fluorescerande markering med ett streptavidin-fykoerytrin och biotinylerat anti-streptavidin-antikroppsförstärkningssystem. Fluorescens detekteras med en högupplöst laserskanner. Läsning och analys av Expression Microarrays: Vi kommer att använda Expression Console av Affymetrix programvara för att utvärdera kvaliteten på mikroarrayerna och kommer att korrigera bakgrundssignalen med standardmetoder [49,50]. För normalisering av signalintensitetsnivå kommer vi att använda "icke-övervakade" metoder, som använder data från alla experimentets mikroarrayer; detta kommer att tillåta oss att göra dessa jämförbara sinsemellan, eftersom vad en mikroarray-analys utvärderar är genuttryck med hjälp av fluorescensintensiteter; därför är det viktigt att fastställa gränspunkter från vilka vi kan överväga under- eller överuttryck. När data är normaliserade är det sista steget att återuppta värdena för alla sönder som finns för varje gen i mikroarrayen i ett enda värde, vilket är genens uttrycksnivå. För detektion av differentiellt uttryckta gener kommer vi att konstruera en linjär modell som inkluderar alla experimentets mikromatriser samtidigt; på detta sätt kommer vi att kunna analysera kontraster mellan grupp A (patienter med metastasering till CNS under uppföljningsperioden) och grupp B (patienter utan metastasering till CNS under samma period). Som intern kontroll kommer vi att bevisa det differentiella uttrycket av vissa gener genom RT-PCR i realtid. Resultaten kommer att representeras i block av värmekartor och i tabeller, där de mest aktiva generna är listade tillsammans med deras funktionsbeskrivning. För validering av riskprofiler kommer vi att utföra korsvalideringsmetod som lämnar en ut och kommer att postulera en andra kohort för detta mål.