Granzyme A chez les patients atteints d'infections urinaires bactériémiques à E. Coli (GABEC)

1. Hypothèse de recherche

L'équipe de recherche a exploré le rôle de GZM A

1. Hypothèse conceptuelle :

   • La granzyme A est un médiateur pathogène du sepsis.
   • Les polymorphismes du gène Granzyme A déterminent la concentration sérique de GZM A chez les patients atteints d'infections systémiques.
   • Les polymorphismes du gène Granzyme A déterminent le risque de septicémie chez les patients atteints d'infections systémiques.

2. Hypothèse opérationnelle :

   • Parmi les patients atteints de bactériémie (E. coli) infections des voies urinaires (IVU), les taux de GZM A sont significativement plus élevés chez les patients qui développent une septicémie par rapport à ceux qui ne développent pas de septicémie.

   • Il existe des différences significatives dans le profil de polymorphisme du gène GZM A des patients atteints de bactériémie (E. coli) les infections urinaires qui développent une septicémie par rapport à celles qui ne développent pas de septicémie.

     2. Buts et objectifs

   • Objectifs

     1. Pour évaluer le rôle pathogène de GZM A dans le sepsis chez les patients atteints de bactériémie (E. coli) IVU.
     2. Explorer la capacité des polymorphismes GZM A à anticiper le risque de développer une septicémie chez les patients atteints de bactériémie (E. coli) IVU.
     3. Évaluer l'utilité potentielle du GZM A en tant que biomarqueur diagnostique du sepsis chez les patients atteints de bactériémie (E. coli) IVU.
     4. Caractériser le "virulome" d'E. coli parmi les souches uropathogènes circulantes.

   • Objectifs

     1. Évaluer la corrélation entre les taux sériques de GZM A et la réponse inflammatoire systémique chez les patients atteints de bactériémie (E. coli) IVU.
     2. Pour caractériser les polymorphismes du gène GZM A chez les patients atteints de bactériémie (E. coli) IVU
     3. Pour évaluer la cinétique sérique du GZM A chez les patients atteints de bactériémie (E. coli) IVU
     4. Caractériser phénotypiquement et moléculairement les souches d'E. coli responsables d'infections urinaires bactériémiques, y compris leurs facteurs de virulence ("virulome").

     3. Résultats attendus.

   • Caractérisation du rôle pathogène du GZM A dans le sepsis chez les patients atteints d'infections systémiques
   • Caractérisation de GZM A comme biomarqueur du sepsis dans un modèle humain d'infection-septicémie.

   • Caractérisation phénotypique et moléculaire des E. coli uropathogènes responsables de bactériémies.

     4. Méthodes

   4.1. Conception et portée du projet

   - Étude prospective et exploratoire cas-témoins nichée à mener dans un hôpital universitaire (Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa) affilié à l'Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (IIS Aragón).

   4.2. Période d'étude : juin 2019 - décembre 2020.

   4.3. Patients et taille de l'échantillon

   Critères d'inclusion (Pour répondre à tous):

   • Âge >= 18 ans.
   • Bactériémie à E. coli

   • Source urinaire. La source urinaire doit être envisagée si (l'un) des éléments suivants :

     1. La source urinaire est cliniquement suspectée et les deux isolats d'E. coli (dans le sang et dans la culture d'urine) partagent le même phénotype (antibiogramme).
     2. La source/l'origine urinaire est cliniquement suspectée et la culture d'urine est négative, mais le patient avait reçu au moins une dose de tout antibiotique systémique ayant une activité antimicrobienne contre la souche d'E. coli responsable de la BSI avant l'obtention des hémocultures.
     3. Les deux isolats (dans le sang et dans la culture d'urine) partagent le même phénotype (antibiogramme) et il n'y a pas de source alternative.

   Critère d'exclusion:

   1. Utilisation d'antibiotiques systémiques pendant > 48h dans les deux mois précédant l'épisode.

   2. Hôtes immunodéprimés - Patients recevant une utilisation systémique de stéroïdes (> 10 mg de prednisone/jour pendant 10 jours ou plus au cours des 2 mois précédents).

      • Patients recevant une thérapie biologique (2 mois précédents).
      • Cancer actif solide ou hématologique.
      • VIH +.
      • Neutropénie < 500 PMN/microl.

   3. Anomalies basales des voies urinaires ou microbiome vésical modifié localement (toutes) :

      - Urétéro-iléostomie, urétérosigmoïdostomie, urétérostomie (Bricker) ou néphrostomie.

      • Sonde urinaire à demeure (au cours des deux derniers mois)
      • Chirurgie urologique (dans les deux derniers mois).
      • Chimiothérapie intravésicale (dans les deux derniers mois).
      • Instillation intravésicale de BCG (dans les deux derniers mois).

      Les candidats potentiels seront détectés quotidiennement par les microbiologistes de l'équipe de recherche. Les critères d'inclusion seront vérifiés lors de la réunion multidisciplinaire que les équipes de gestion des antimicrobiens (AST) organisent quotidiennement dans l'hôpital participant.

      Estimation de la taille de la population étudiée. Correspondant à:

      - 50 patients avec un ratio sepsis/non sepsis 1:1 seront inclus.

      - Les patients septiques et non septiques seront appariés sur le sexe, l'âge (+/- 10 ans), la comorbidité (score de Charlson +/-1), le délai d'apparition des symptômes à l'hémoculture (+/- 24h)

      4.4. Définitions

      Cas (septicémie / choc septique) :

      - La septicémie ou le choc septique sont définis comme un dysfonctionnement organique potentiellement mortel causé par une réponse dérégulée de l'hôte à l'infection selon la Conférence internationale de définition de la septicémie 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      Contrôles:

      - Absence de sepsis ou de choc septique selon la Conférence internationale de définition du sepsis 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      4.5. variables

      4.5.1. Variables liées au patient :

      - Démographique : sexe, âge.

      • Comorbidité : indice de Charlson modifié
      • Créatinine sérique de base.

      4.5.2. Variables liées à l'infection.

      - Délai entre l'apparition des symptômes et le début du traitement antimicrobien.

      - Délai entre l'apparition des symptômes et le début d'un traitement antimicrobien approprié.

      - Délai entre l'apparition des symptômes et le traitement chirurgical (si nécessaire).

      • Gravité clinique au temps 0 (hémoculture), et à J2-3 et J30 : score de sepsis.

      4.5.3. Inflammation, médiateurs du sepsis et biomarqueurs. - Les biomarqueurs suivants seront déterminés lors de l'inscription des patients : - Numération et formule leucocytaire. - La numération plaquettaire. - Fibrinogène. - Activité prothrombique.

      - Protéine C-réactive.

      • Procalcitonine.
      • GZM A.

      Les taux sériques de GZM A seront obtenus chez tous les patients lors de la visite d'inscription, des visites de 2-3 jours et de 30 jours (cinétique GZM A). Les niveaux de GZM A seront déterminés par un test commercial ELISA (Human Granzyme A ELISA development kit {HRP] ; Mabtech).

      Les polymorphismes du gène GzmA, ainsi que d'autres mutations potentiellement associées, seront criblés par Whole Exome Sequencing (WES). Dans ce but, nous utiliserons l'ADN isolé des cellules du sang périphérique et le kit technologique AmpliSeq sur la plateforme Ion Torrent en suivant les instructions du fabricant. Cette plateforme est disponible à l'Unité centrale de recherche en génomique (CRU) du CIBA de l'Université de Saragosse/IIS Aragon. Tous les kits d'isolement et d'analyse des échantillons d'ADN sont disponibles dans le commerce et optimisés par Thermo Scientific. L'analyse bioinformatique sera effectuée par un accord établi entre Genomics CRU et Micromics SL dirigé par Pedro Gonzalez au CRG de Barcelone.

      4.5.4. Variables microbiologiques

      • Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des isolats d'E. coli extraits de l'urine et des hémocultures seront déterminées par des panels de microdilution automatisés, comme cela est régulièrement effectué par le laboratoire de microbiologie des hôpitaux participants.
      • Séquençage du génome entier (WGS) des souches d'E. coli isolées dans les cultures de sang et d'urine. La présence de facteurs de virulence connus d'E. coli sera analysée et un score de virulence pour chaque souche sera calculé (Mora-Rillo et al., 2015).