Granzyme A u pacientů s E. coli bakteriemickými infekcemi močových cest (GABEC)

1. Výzkumná hypotéza

Výzkumný tým prozkoumal roli GZM A

1. Koncepční hypotéza:

   • Granzym A je patogenní mediátor sepse.
   • Polymorfismy genu Granzyme A určují sérovou koncentraci GZM A u pacientů se systémovými infekcemi.
   • Polymorfismy genu Granzyme A určují riziko sepse u pacientů se systémovými infekcemi.

2. Operační hypotéza:

   • Mezi pacienty s bakteriémií (E. coli) infekce močových cest (UTI), hladiny GZM A jsou významně vyšší u pacientů, u kterých se rozvine sepse, ve srovnání s těmi, u kterých se sepse nevyvine.

   • Existují významné rozdíly v profilu polymorfismu genu GZM A u pacientů s bakteremií (E. coli) UTI, u kterých se rozvine sepse ve srovnání s těmi, u kterých se sepse nevyvine.

     2. Cíle a cíle

   • Cíle

     1. Posoudit patogenní roli GZM A při sepsi u pacientů s bakteremií (E. coli) UTI.
     2. Prozkoumat schopnost polymorfismů GZM A předvídat riziko rozvoje sepse u pacientů s bakteremií (E. coli) UTI.
     3. Vyhodnotit potenciální užitečnost GZM A jako diagnostického biomarkeru sepse u pacientů s bakteremií (E. coli) UTI.
     4. Charakterizovat E. coli "virulom" mezi cirkulujícími uropatogenními kmeny.

   • Cíle

     1. K vyhodnocení korelace mezi sérovými hladinami GZM A a systémovou zánětlivou odpovědí u pacientů s bakteriémií (E. coli) UTI.
     2. Charakterizovat polymorfismy genu GZM A u pacientů s bakteremií (E. coli) UTI
     3. K posouzení sérové ​​kinetiky GZM A u pacientů s bakteremií (E. coli) UTI
     4. Fenotypově a molekulárně charakterizovat kmeny E. coli způsobující bakteriemické infekce močových cest, včetně jejich faktorů virulence ("virulom").

     3. Očekávané výsledky.

   • Charakterizace patogenní role GZM A v sepsi u pacientů se systémovými infekcemi
   • Charakterizace GZM A jako biomarkeru sepse v lidském modelu infekční sepse.

   • Fenotypová a molekulární charakterizace uropatogenních E. coli způsobujících infekce krevního řečiště.

     4. Metody

   4.1. Návrh a rozsah projektu

   - Prospektivní, průzkumná vnořená případová-kontrolní studie, která bude provedena v jedné akademické nemocnici (Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa) přidružené k Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (IIS Aragón).

   4.2. Studijní období: červen 2019 - prosinec 2020.

   4.3. Pacienti a velikost vzorku

   Kritéria zařazení (pro splnění všech):

   • Věk >= 18 let.
   • Infekce krevního řečiště E. coli

   • Močový zdroj. Zdroj moči by měl být zvažován, pokud (kterýkoli) z následujících:

     1. Močový zdroj je klinicky podezřelý a oba izoláty E. coli (v krvi i v kultuře moči) sdílejí stejný fenotyp (antibiogram).
     2. Močový zdroj/původ je klinicky podezřelý a kultivace moči je negativní, ale pacient dostal alespoň jednu dávku jakéhokoli systémového antibiotika s antimikrobiální aktivitou proti kmeni E. coli způsobujícímu BSI před získáním hemokultur.
     3. Oba izoláty (v krvi a v kultuře moči) sdílejí stejný fenotyp (antibiogram) a neexistuje žádný alternativní zdroj.

   Kritéria vyloučení:

   1. Použití systémových antibiotik po dobu > 48 hodin během dvou měsíců před epizodou.

   2. Imunokompromitovaní hostitelé - Pacienti užívající systémové steroidy (>10 mg prednisonu/den během 10 nebo více dnů v předchozích 2 měsících).

      • Pacienti podstupující biologickou léčbu (předchozí 2 měsíce).
      • Aktivní solidní nebo hematologická rakovina.
      • HIV +.
      • Neutropenie < 500 PMN/mikrol.

   3. Abnormality bazálních močových cest nebo lokálně modifikovaný vesikální mikrobiom (jakýkoli):

      - Ureteroileostomie, ureterosigmoidostomie, ureterostomie (Bricker) nebo nefrostomie.

      • Zavedený močový katétr (v posledních dvou měsících)
      • Urologická chirurgie (v posledních dvou měsících).
      • Intravezikální chemoterapie (v posledních dvou měsících).
      • Intravezikální instilace BCG (v posledních dvou měsících).

      Potenciální kandidáty budou denně odhalovat mikrobiologové z výzkumného týmu. Kritéria pro zařazení budou ověřena na multidisciplinárním setkání, které týmy antimikrobiálního dozoru (AST) provádějí denně v zúčastněné nemocnici.

      Odhadovaná velikost studované populace. Vhodný:

      - Bude zahrnuto 50 pacientů s poměrem sepse/nesepse 1:1.

      - Septičtí a neseptičtí pacienti budou přiřazeni podle pohlaví, věku (+/- 10 let), komorbidity (Charlsonovo skóre +/-1), času nástupu příznaků do hemokultury (+/- 24h)

      4.4. Definice

      Případy (sepse / septický šok):

      - Sepse nebo šoková septika jsou definovány jako život ohrožující orgánová dysfunkce způsobená dysregulovanou reakcí hostitele na infekci podle mezinárodní konference o definici sepse z roku 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      Řízení:

      - Absence sepse nebo septického šoku podle mezinárodní konference definice sepse z roku 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      4.5. Proměnné

      4.5.1. Proměnné související s pacientem:

      - Demografické: pohlaví, věk.

      • Komorbidita: Modifikovaný Charlsonův index
      • Základní sérový kreatinin.

      4.5.2. Proměnné související s infekcí.

      - Doba od nástupu příznaků do zahájení antimikrobiální léčby.

      - Doba od nástupu příznaků do zahájení vhodné antimikrobiální léčby.

      - Čas od nástupu příznaků do chirurgické terapie (je-li potřeba).

      • Klinická závažnost v čase 0 (krevní kultivace) a den 2-3 a den 30: skóre sepse.

      4.5.3. Zánět, mediátory sepse a biomarkery. - Během zařazování pacientů budou stanoveny následující biomarkery: - Počet a diferenciál bílých krvinek. - Počet krevních destiček. - Fibrinogen. - Protrombinová aktivita.

      - C reaktivní protein.

      • Prokalcitonin.
      • GZM A.

      Hladiny GZM A v séru budou získány u všech pacientů během návštěvy zařazování, 2-3denní a 30denní návštěvy (kinetika GZM A). Hladiny GZM A budou stanoveny komerčním testem ELISA (vývojový kit Human Granzyme A ELISA {HRP]; Mabtech).

      Polymorfismy genu GzmA, stejně jako další potenciálně související mutace, budou testovány pomocí Whole Exome Sequencing (WES). K tomuto účelu použijeme DNA izolovanou z buněk periferní krve a technologickou sadu AmpliSeq na platformě Ion Torrent podle pokynů výrobce. Tato platforma je dostupná v Genomics Central Research Unit (CRU) při CIBA z University of Zaragoza/IIS Aragon. Všechny soupravy pro izolaci a analýzu vzorků DNA jsou komerčně dostupné a optimalizovány společností Thermo Scientific. Bioninformatická analýza bude provedena na základě dohody uzavřené mezi Genomics CRU a Micromics SL pod vedením Pedra Gonzaleze na CRG v Barceloně.

      4.5.4. Mikrobiologické proměnné

      • Minimální inhibiční koncentrace (MIC) izolátů E. coli získaných z močových a krevních kultur budou stanoveny pomocí automatizovaných mikrodilučních panelů, jak to rutinně provádí mikrobiologická laboratoř zúčastněných nemocnic.
      • Sekvenování celého genomu (WGS) kmenů E. coli izolovaných v kulturách krve a moči. Bude analyzována přítomnost známých faktorů virulence E. coli a bude vypočteno skóre virulence pro každý kmen (Mora-Rillo et al., 2015).