Granzima A en pacientes con infecciones urinarias bacteriémicas por E. Coli (GABEC)

1. Hipótesis de investigación

El equipo de investigación ha explorado el papel de GZM A

1. Hipótesis conceptual:

   • La granzima A es un mediador patógeno de la sepsis.
   • Los polimorfismos del gen de la granzima A determinan la concentración sérica de GZM A en pacientes con infecciones sistémicas.
   • Los polimorfismos del gen de la granzima A determinan el riesgo de sepsis en pacientes con infecciones sistémicas.

2. Hipótesis operativa:

   • Entre los pacientes con bacteriemia (E. coli) infecciones del tracto urinario (ITU), los niveles de GZM A son significativamente más altos en aquellos pacientes que desarrollan sepsis en comparación con aquellos que no desarrollan sepsis.

   • Existen diferencias significativas en el perfil de polimorfismo del gen GZM A de pacientes con bacteriemia (E. coli) UTI que desarrollan sepsis en comparación con aquellos que no desarrollan sepsis.

     2. Fines y objetivos

   • Objetivos

     1. Evaluar el papel patogénico de GZM A en la sepsis en pacientes con bacteriemia (E. coli) ITU.
     2. Explorar la capacidad de los polimorfismos GZM A para anticipar el riesgo de desarrollar sepsis en pacientes con bacteriemia (E. coli) ITU.
     3. Evaluar la utilidad potencial de GZM A como biomarcador diagnóstico de sepsis en pacientes con bacteriemia (E. coli) ITU.
     4. Caracterizar el "viruloma" de E. coli entre las cepas uropatógenas circulantes.

   • Objetivos

     1. Evaluar la correlación entre los niveles séricos de GZM A y la respuesta inflamatoria sistémica en pacientes con bacteriemia (E. coli) ITU.
     2. Caracterizar los polimorfismos del gen GZM A entre pacientes con bacteriemia (E. coli) ITU
     3. Para evaluar la cinética sérica de GZM A entre pacientes con bacteriemia (E. coli) ITU
     4. Caracterizar fenotípica y molecularmente las cepas de E. coli causantes de infecciones urinarias bacteriémicas, incluidos sus factores de virulencia ("viruloma").

     3. Resultados esperados.

   • Caracterización del papel patogénico de GZM A en sepsis en pacientes con infecciones sistémicas
   • Caracterización de GZM A como biomarcador de sepsis en un modelo humano de infección-sepsis.

   • Caracterización fenotípica y molecular de E. coli uropatógena causante de infecciones del torrente sanguíneo.

     4. Métodos

   4.1. Diseño y alcance del proyecto

   - Estudio prospectivo, exploratorio anidado de casos y controles a realizar en un hospital académico (Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa) adscrito al Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (IIS Aragón).

   4.2. Período de estudio: junio 2019 - diciembre 2020.

   4.3. Pacientes y tamaño de la muestra

   Criterios de inclusión (Para cumplir con todos):

   • Edad >= 18 años.
   • Infección del torrente sanguíneo por E. coli

   • Fuente urinaria. Se debe considerar la fuente urinaria si (cualquiera) de los siguientes:

     1. Se sospecha clínicamente de origen urinario y ambos aislados de E. coli (en sangre y en urocultivo) comparten el mismo fenotipo (antibiograma).
     2. Se sospecha clínicamente una fuente/origen urinario y el urocultivo es negativo, pero el paciente había recibido al menos una dosis de cualquier antibiótico sistémico con actividad antimicrobiana contra la cepa de E. coli que causa la BSI antes de obtener los hemocultivos.
     3. Ambos aislados (en sangre y en urocultivo) comparten el mismo fenotipo (antibiograma) y no existe una fuente alternativa.

   Criterio de exclusión:

   1. Uso de antibióticos sistémicos durante >48h en los dos meses previos al episodio.

   2. Huéspedes inmunocomprometidos - Pacientes que reciben uso de esteroides sistémicos (>10 mg de prednisona/día durante 10 o más días en los 2 meses anteriores).

      • Pacientes en tratamiento biológico (2 meses previos).
      • Cáncer sólido o hematológico activo.
      • VIH+.
      • Neutropenia < 500 PMN/microl.

   3. Anormalidades del tracto urinario basal o microbioma vesical modificado localmente (cualquiera):

      - Ureteroileostomía, ureterosigmoidostomía, ureterostomía (Bricker) o nefrostomía.

      • Catéter urinario permanente (en los últimos dos meses)
      • Cirugía urológica (en los dos últimos meses).
      • Quimioterapia intravesical (en los dos últimos meses).
      • Instilación intravesical de BCG (en los dos últimos meses).

      Los candidatos potenciales serán detectados diariamente por los microbiólogos del equipo de investigación. Los criterios de inclusión serán verificados en la reunión multidisciplinaria que los equipos de administración de antimicrobianos (AST) realizan diariamente en el hospital participante.

      Tamaño estimado de la población de estudio. Pareo:

      - Se incluirán 50 pacientes con relación sepsis/no sepsis 1:1.

      - Los pacientes sépticos y no sépticos se emparejarán por sexo, edad (+/- 10 años), comorbilidad (puntuación de Charlson +/-1), tiempo de aparición de los síntomas hasta el hemocultivo (+/- 24h)

      4.4. Definiciones

      Casos (sepsis/shock séptico):

      - La sepsis o shock séptico se definen como una disfunción orgánica potencialmente mortal causada por una respuesta desregulada del huésped a la infección según la Conferencia Internacional de Definición de Sepsis de 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      Control S:

      - Ausencia de sepsis o shock séptico según SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definition Conference 2001.

      4.5. Variables

      4.5.1. Variables relacionadas con el paciente:

      - Demográficas: sexo, edad.

      • Comorbilidad: Índice de Charlson modificado
      • Creatinina sérica basal.

      4.5.2. Variables relacionadas con la infección.

      - Tiempo desde el inicio de los síntomas hasta el inicio del tratamiento antimicrobiano.

      - Tiempo desde el inicio de los síntomas hasta el inicio del tratamiento antimicrobiano adecuado.

      - Tiempo desde el inicio de los síntomas hasta la terapia quirúrgica (si es necesario).

      • Gravedad clínica en el momento 0 (cultivo de sangre), y los días 2-3 y día 30: puntuación de sepsis.

      4.5.3. Inflamación, mediadores de sepsis y biomarcadores. - Los siguientes biomarcadores se determinarán durante la inscripción del paciente: - Recuento y diferencial de glóbulos blancos. - Recuento de plaquetas. - Fibrinógeno. - Actividad de la protrombina.

      - Proteína C-reactiva.

      • Procalcitonina.
      • GZM A.

      Los niveles séricos de GZM A se obtendrán en todos los pacientes durante la visita de inscripción, las visitas de 2-3 días y de 30 días (cinética de GZM A). Los niveles de GZM A se determinarán mediante un ensayo comercial ELISA (Human Granzyme A ELISA development kit{HRP]; Mabtech).

      Los polimorfismos del gen GzmA, así como otras mutaciones potencialmente asociadas, se examinarán mediante secuenciación completa del exoma (WES). Para ello utilizaremos ADN aislado de células de sangre periférica y el kit de tecnología AmpliSeq en la plataforma Ion Torrent siguiendo las instrucciones del fabricante. Esta plataforma está disponible en la Unidad Central de Investigación en Genómica (CRU) del CIBA de la Universidad de Zaragoza/IIS Aragón. Todos los kits para aislar y analizar muestras de ADN están disponibles comercialmente y optimizados por Thermo Scientific. El análisis bioinformático se realizará mediante un acuerdo establecido entre Genomics CRU y Micromics SL liderado por Pedro González en el CRG de Barcelona.

      4.5.4. Variables microbiológicas

      • Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de los aislamientos de E. coli recuperados de cultivos de orina y sangre se determinarán a través de paneles de microdilución automatizados como lo realiza de forma rutinaria el laboratorio de microbiología de los hospitales participantes.
      • Secuenciación del genoma completo (WGS) de las cepas de E. coli aisladas en hemocultivos y urocultivos. Se analizará la presencia de factores de virulencia conocidos de E. coli y se calculará una puntuación de virulencia para cada cepa (Mora-Rillo et al., 2015).