Гранзим А у пациентов с бактериальными инфекциями мочевыводящих путей, вызванными E. Coli (GABEC)

1. Гипотеза исследования

Исследовательская группа изучила роль GZM A.

1. Концептуальная гипотеза:

   • Гранзим А является патогенным медиатором сепсиса.
   • Полиморфизмы гена гранзима А определяют концентрацию GZM A в сыворотке крови у пациентов с системными инфекциями.
   • Полиморфизмы гена гранзима А определяют риск развития сепсиса у пациентов с системными инфекциями.

2. Рабочая гипотеза:

   • Среди больных бактериемией (E. coli) инфекции мочевыводящих путей (ИМП), уровни GZM A значительно выше у пациентов, у которых развивается сепсис, по сравнению с теми, у кого сепсиса нет.

   • Имеются существенные различия в профиле полиморфизма гена GZM A у пациентов с бактериемией (E. coli) ИМП, у которых развивается сепсис, по сравнению с теми, у кого сепсиса не развивается.

     2. Цели и задачи

   • Цели

     1. Для оценки патогенной роли ГЗМ-А при сепсисе у больных с бактериемией (E. coli) ИМП.
     2. Изучить способность полиморфизмов GZM A прогнозировать риск развития сепсиса у пациентов с бактериемией (E. coli) ИМП.
     3. Чтобы оценить потенциальную полезность GZM A в качестве диагностического биомаркера сепсиса у пациентов с бактериемией (E. coli) ИМП.
     4. Охарактеризовать «вирулом» E. coli среди циркулирующих уропатогенных штаммов.

   • Цели

     1. Для оценки корреляции между уровнями ГЗМ-А в сыворотке крови и системным воспалительным ответом у пациентов с бактериемией (E. coli) ИМП.
     2. Для характеристики полиморфизмов гена GZM A у больных бактериемией (E. coli) ИМП
     3. Для оценки кинетики ГЗМ-А в сыворотке крови у пациентов с бактериемией (E. coli) ИМП
     4. Фенотипически и молекулярно охарактеризовать штаммы E. coli, вызывающие бактериемические ИМП, включая их факторы вирулентности («вируломы»).

     3. Ожидаемые результаты.

   • Характеристика патогенной роли ГЗМ-А при сепсисе у больных с системными инфекциями
   • Характеристика GZM A как биомаркера сепсиса в модели инфекционного сепсиса человека.

   • Фенотипическая и молекулярная характеристика уропатогенных кишечных палочек, вызывающих инфекции кровотока.

     4. Методы

   4.1. Дизайн и объем проекта

   - Проспективное предварительное вложенное исследование случай-контроль, которое будет проведено в одной академической больнице (Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa), связанной с Instituto de Investigacion Sanitaria Aragón (IIS Aragón).

   4.2. Период обучения: июнь 2019 г. - декабрь 2020 г.

   4.3. Пациенты и размер выборки

   Критерии включения (для удовлетворения всех):

   • Возраст >= 18 лет.
   • Инфекция кровотока E. coli

   • Мочевой источник. Источник мочи следует рассматривать, если (любое) из следующего:

     1. Клинически подозревается мочевой источник, и оба изолята E. coli (в крови и в моче) имеют одинаковый фенотип (антибиограмма).
     2. Клинически подозревается мочевой источник/происхождение, и посев мочи отрицательный, но пациент получил по крайней мере одну дозу любого системного антибиотика с противомикробной активностью против штамма E. coli, вызывающего BSI, до того, как был получен посев крови.
     3. Оба изолята (в крови и в моче) имеют один и тот же фенотип (антибиограмма), и альтернативного источника нет.

   Критерий исключения:

   1. Использование системных антибиотиков в течение >48 часов в течение двух месяцев, предшествующих эпизоду.

   2. Пациенты с ослабленным иммунитетом - пациенты, получающие системные стероиды (> 10 мг преднизона в день в течение 10 или более дней в течение предыдущих 2 месяцев).

      • Пациенты, получающие биологическую терапию (предыдущие 2 мес).
      • Активный солидный или гематологический рак.
      • ВИЧ+.
      • Нейтропения < 500 пмн/мкл.

   3. Аномалии базальных мочевыводящих путей или локально измененный микробиом мочевого пузыря (любой):

      - Уретероилеостомия, уретеросигмоидостомия, уретеростома (по Брикеру) или нефростомия.

      • Постоянный мочевой катетер (за последние два месяца)
      • Урологические операции (за последние два месяца).
      • Внутрипузырная химиотерапия (в последние два месяца).
      • Внутрипузырная инстилляция БЦЖ (в течение последних двух месяцев).

      Потенциальные кандидаты будут ежедневно выявляться микробиологами исследовательской группы. Критерии включения будут проверены на междисциплинарном совещании, которое ежедневно проводят группы по управлению противомикробными препаратами (AST) в участвующей больнице.

      Предполагаемый размер исследуемой популяции. Соответствие:

      - Будут включены 50 пациентов с соотношением сепсис/не сепсис 1:1.

      - Септические и несептические пациенты будут сопоставимы по полу, возрасту (+/- 10 лет), сопутствующим заболеваниям (оценка Чарлсона +/-1), времени появления симптомов до посева крови (+/- 24 часа)

      4.4. Определения

      Случаи (сепсис/септический шок):

      - Сепсис или септический шок определяются как опасная для жизни дисфункция органов, вызванная нерегулируемой реакцией хозяина на инфекцию в соответствии с Международной конференцией по определению сепсиса 2001 г. SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      Элементы управления:

      - Отсутствие сепсиса или септического шока в соответствии с Международной конференцией по определению сепсиса 2001 г. SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      4.5. Переменные

      4.5.1. Переменные, связанные с пациентом:

      - Демографические: пол, возраст.

      • Сопутствующая патология: модифицированный индекс Чарльсона
      • Базовый уровень креатинина сыворотки.

      4.5.2. Переменные, связанные с инфекцией.

      - Время от появления симптомов до начала антимикробного лечения.

      - Время от появления симптомов до начала соответствующего антимикробного лечения.

      - Время от появления симптомов до хирургического лечения (при необходимости).

      • Клиническая тяжесть в момент времени 0 (культура крови), а также на 2–3-й и 30-й день: оценка сепсиса.

      4.5.3. Медиаторы воспаления, сепсиса и биомаркеры. - Следующие биомаркеры будут определяться во время регистрации пациентов: - Подсчет лейкоцитов и дифференциальный диагноз. - Количество тромбоцитов. - Фибриноген. - Протромбиновая активность.

      - С-реактивный белок.

      • Прокальцитонин.
      • ГЗМ А.

      Уровни GZM-A в сыворотке будут получены у всех пациентов во время визита для включения в исследование, 2-3-дневного и 30-дневного визитов (кинетика GZM-A). Уровни GZM A будут определяться с помощью коммерческого анализа ELISA (набор для разработки ELISA Human Granzyme A{HRP]; Mabtech).

      Полиморфизмы гена GzmA, а также другие потенциально связанные мутации будут проверены с помощью полноэкзомного секвенирования (WES). С этой целью мы будем использовать ДНК, выделенную из клеток периферической крови, и технологический набор AmpliSeq на платформе Ion Torrent, следуя инструкциям производителя. Эта платформа доступна в Центральном исследовательском центре геномики (CRU) CIBA Университета Сарагосы/IIS Aragon. Все наборы для выделения и анализа образцов ДНК имеются в продаже и оптимизированы компанией Thermo Scientific. Биоинформатический анализ будет проводиться в соответствии с соглашением, заключенным между Genomics CRU и Micromics SL под руководством Педро Гонсалеса из CRG в Барселоне.

      4.5.4. Микробиологические переменные

      • Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) изолятов E. coli, извлеченных из мочи и посевов крови, будут определяться с помощью автоматических панелей микроразведений, как это обычно делается микробиологической лабораторией участвующих больниц.
      • Полногеномное секвенирование (WGS) штаммов E. coli, выделенных в культурах крови и мочи. Будет проанализировано наличие известных факторов вирулентности E. coli, и будет рассчитан показатель вирулентности для каждого штамма (Mora-Rillo et al., 2015).