Granzima A em Pacientes com Infecções Bacterêmicas do Trato Urinário por E. Coli (GABEC)

1. Hipótese de pesquisa

A equipe de pesquisa explorou o papel do GZM A

1. Hipótese conceitual:

   • A granzima A é um mediador patogênico da sepse.
   • Os polimorfismos do gene da granzima A determinam a concentração sérica de GZM A em pacientes com infecções sistêmicas.
   • Polimorfismos do gene da granzima A determinam o risco de sepse em pacientes com infecções sistêmicas.

2. Hipótese operacional:

   • Entre os pacientes com bacteremia (E. coli) infecções do trato urinário (ITUs), os níveis de GZM A são significativamente mais altos nos pacientes que desenvolvem sepse em comparação com aqueles que não desenvolvem sepse.

   • Existem diferenças significativas no perfil de polimorfismo do gene GZM A de pacientes com bacteremia (E. coli) ITUs que desenvolvem sepse em comparação com aqueles que não desenvolvem sepse.

     2. Metas e objetivos

   • Mira

     1. Para avaliar o papel patogênico do GZM A na sepse em pacientes com bacteremia (E. coli) ITUs.
     2. Para explorar a capacidade dos polimorfismos GZM A de antecipar o risco de desenvolver sepse em pacientes com bacteremia (E. coli) ITUs.
     3. Avaliar a potencial utilidade do GZM A como um biomarcador diagnóstico de sepse em pacientes com bacteremia (E. coli) ITUs.
     4. Caracterizar o "viruloma" de E. coli entre as cepas uropatogênicas circulantes.

   • Objetivos

     1. Avaliar a correlação entre os níveis séricos de GZM A e a resposta inflamatória sistêmica em pacientes com bacteremia (E. coli) ITUs.
     2. Para caracterizar os polimorfismos do gene GZM A entre pacientes com bacteremia (E. coli) ITUs
     3. Para avaliar a cinética sérica de GZM A entre pacientes com bacteremia (E. coli) ITUs
     4. Caracterizar fenotípica e molecularmente cepas de E. coli causadoras de ITUs bacterêmicas, incluindo seus fatores de virulência ("viruloma").

     3. Resultados esperados.

   • Caracterização do papel patogênico do GZM A na sepse em pacientes com infecções sistêmicas
   • Caracterização de GZM A como um biomarcador de sepse em um modelo humano de infecção-sepse.

   • Caracterização fenotípica e molecular de E. coli uropatogênica causadora de infecções da corrente sanguínea.

     4. Métodos

   4.1. Projeto e escopo do projeto

   - Estudo prospectivo, exploratório de caso-controle aninhado a ser realizado em um hospital universitário (Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa) afiliado ao Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (IIS Aragón).

   4.2. Período do estudo: junho de 2019 a dezembro de 2020.

   4.3. Pacientes e tamanho da amostra

   Critérios de inclusão (Para atender a todos):

   • Idade >= 18 anos.
   • Infecção da corrente sanguínea por E. coli

   • Fonte urinária. A fonte urinária deve ser considerada se (qualquer) um dos seguintes:

     1. Suspeita-se clinicamente da fonte urinária e ambos os isolados de E. coli (no sangue e na cultura de urina) compartilham o mesmo fenótipo (antibiograma).
     2. Suspeita-se clinicamente da fonte/origem urinária e a urocultura é negativa, mas o paciente recebeu pelo menos uma dose de qualquer antibiótico sistêmico com atividade antimicrobiana contra a cepa de E. coli causadora da BSI antes da obtenção das hemoculturas.
     3. Ambos os isolados (no sangue e na cultura de urina) compartilham o mesmo fenótipo (antibiograma) e não há fonte alternativa.

   Critério de exclusão:

   1. Uso de antibióticos sistêmicos por >48h nos dois meses anteriores ao episódio.

   2. Hospedeiros imunocomprometidos - Pacientes em uso de esteroides sistêmicos (>10 mg de prednisona/dia durante 10 ou mais dias nos últimos 2 meses).

      • Pacientes recebendo terapia biológica (2 meses anteriores).
      • Câncer sólido ou hematológico ativo.
      • HIV+.
      • Neutropenia < 500 PMN/microl.

   3. Anormalidades basais do trato urinário ou microbioma vesical localmente modificado (qualquer):

      - Ureteroileostomia, ureterosigmoidostomia, ureterostomia (Bricker) ou nefrostomia.

      • Cateter vesical de demora (nos últimos dois meses)
      • Cirurgia urológica (nos últimos dois meses).
      • Quimioterapia intravesical (nos últimos dois meses).
      • Instilação intravesical de BCG (nos últimos dois meses).

      Os candidatos potenciais serão detectados diariamente pelos microbiologistas da equipe de pesquisa. Os critérios de inclusão serão verificados na reunião multidisciplinar que as equipes de manejo de antimicrobianos (AST) realizam diariamente no hospital participante.

      Tamanho estimado da população do estudo. Coincidindo:

      - Serão incluídos 50 pacientes com relação sepse/não sepse 1:1.

      - Pacientes sépticos e não sépticos serão pareados por sexo, idade (+/- 10 anos), comorbidade (escore de Charlson +/-1), tempo de início dos sintomas para hemocultura (+/- 24h)

      4.4. Definições

      Casos (sepse/choque séptico):

      - Sepse ou choque séptico são definidos como disfunção orgânica com risco de vida causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção de acordo com a Conferência Internacional de Definição de Sepse de 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      Controles:

      - Ausência de sepse ou choque séptico de acordo com a Conferência Internacional de Definição de Sepse de 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      4.5. Variáveis

      4.5.1. Variáveis ​​relacionadas ao paciente:

      - Dados demográficos: sexo, idade.

      • Comorbidade: Índice de Charlson modificado
      • Creatinina sérica basal.

      4.5.2. Variáveis ​​relacionadas à infecção.

      - Tempo desde o início dos sintomas até o início do tratamento antimicrobiano.

      - Tempo desde o início dos sintomas até o início do tratamento antimicrobiano adequado.

      - Tempo desde o início dos sintomas até a terapia cirúrgica (se necessário).

      • Gravidade clínica no tempo 0 (hemocultura), e dia 2-3 e dia 30: pontuação de sepse.

      4.5.3. Inflamação, mediadores de sepse e biomarcadores. - Os seguintes biomarcadores serão determinados durante a inscrição do paciente: - Contagem e diferencial de glóbulos brancos. - Contagem de plaquetas. - Fibrinogênio. - Atividade de protrombina.

      - Proteína C-reativa.

      • Procalcitonina.
      • GZM A.

      Os níveis séricos de GZM A serão obtidos em todos os pacientes durante a visita de inscrição, as visitas de 2-3 dias e de 30 dias (cinética de GZM A). Os níveis de GZM A serão determinados por um ensaio comercial ELISA (kit de desenvolvimento Human Granzyme A ELISA{HRP]; Mabtech).

      Os polimorfismos do gene GzmA, assim como outras mutações potencialmente associadas, serão triados por Sequenciamento de Exoma Total (WES). Para tanto, utilizaremos DNA isolado de células sanguíneas periféricas e o kit da tecnologia AmpliSeq na plataforma Ion Torrent seguindo as instruções do fabricante. Esta plataforma está disponível na Unidade Central de Pesquisa Genômica (CRU) do CIBA da Universidade de Zaragoza/IIS Aragon. Todos os kits para isolar e analisar amostras de DNA estão disponíveis comercialmente e são otimizados pela Thermo Scientific. A análise bioinformática será realizada por um acordo estabelecido entre Genomics CRU e Micromics SL liderado por Pedro Gonzalez no CRG em Barcelona.

      4.5.4. Variáveis ​​microbiológicas

      • As concentrações inibitórias mínimas (CIM) dos isolados de E. coli obtidos de urina e hemoculturas serão determinadas através de painéis de microdiluição automatizados realizados rotineiramente pelo Laboratório de Microbiologia dos hospitais participantes.
      • Sequenciamento completo do genoma (WGS) das cepas de E. coli isoladas em culturas de sangue e urina. A presença de fatores de virulência conhecidos de E. coli será analisada e um escore de virulência para cada cepa será calculado (Mora-Rillo et al., 2015).