Granzym A u pacjentów z bakteryjnymi zakażeniami dróg moczowych E. coli (GABEC)

1. Hipoteza badawcza

Zespół badawczy zbadał rolę GZM A

1. Hipoteza koncepcyjna:

   • Granzym A jest patogennym mediatorem sepsy.
   • Polimorfizmy genu granzymu A determinują stężenie GZM A w surowicy pacjentów z zakażeniami ogólnoustrojowymi.
   • Polimorfizmy genu granzymu A warunkują ryzyko wystąpienia sepsy wśród pacjentów z zakażeniami ogólnoustrojowymi.

2. Hipoteza operacyjna:

   • Wśród pacjentów z bakteriemią (E. coli) infekcje dróg moczowych (ZUM), poziomy GZM A są znacznie wyższe u pacjentów, u których rozwinęła się sepsa, w porównaniu z tymi, u których nie rozwinęła się sepsa.

   • Istnieją istotne różnice w profilu polimorfizmu genu GZM A u pacjentów z bakteriemią (E. coli) ZUM, u których rozwija się posocznica, w porównaniu z tymi, u których nie rozwija się posocznica.

     2. Cele i cele

   • Celuje

     1. Ocena patogennej roli GZM A w sepsie u pacjentów z bakteriemią (E. coli) ZUM.
     2. Zbadanie zdolności polimorfizmów GZM A do przewidywania ryzyka rozwoju sepsy u pacjentów z bakteriemią (E. coli) ZUM.
     3. Ocena potencjalnej przydatności GZM A jako biomarkera diagnostycznego sepsy u pacjentów z bakteriemią (E. coli) ZUM.
     4. Scharakteryzowanie „wirulomu” E. coli wśród krążących uropatogennych szczepów.

   • Cele

     1. Aby ocenić korelację między poziomem GZM A w surowicy a ogólnoustrojową odpowiedzią zapalną u pacjentów z bakteriemią (E. coli) ZUM.
     2. Aby scharakteryzować polimorfizmy genu GZM A wśród pacjentów z bakteriemią (E. coli) ZUM
     3. Ocena kinetyki GZM A w surowicy pacjentów z bakteriemią (E. coli) ZUM
     4. Fenotypowo i molekularnie scharakteryzować szczepy E. coli powodujące bakteriemię ZUM, w tym ich czynniki wirulencji („wirulom”).

     3. Oczekiwane rezultaty.

   • Charakterystyka patogennej roli GZM A w sepsie u pacjentów z zakażeniami ogólnoustrojowymi
   • Charakterystyka GZM A jako biomarkera sepsy w ludzkim modelu infekcji-posocznicy.

   • Fenotypowa i molekularna charakterystyka uropatogennych E. coli powodujących zakażenia krwi.

     4. Metody

   4.1. Projekt i zakres projektu

   - Prospektywne, eksploracyjne zagnieżdżone badanie kliniczno-kontrolne do przeprowadzenia w jednym szpitalu akademickim (Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa) stowarzyszonym z Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (IIS Aragón).

   4.2. Okres studiów: czerwiec 2019 - grudzień 2020.

   4.3. Pacjenci i wielkość próby

   Kryteria włączenia (spełnienie wszystkich):

   • Wiek >= 18 lat.
   • Zakażenie krwi E. coli

   • Źródło moczu. Źródło moczu należy rozważyć, jeśli (jakieś) z poniższych:

     1. Klinicznie podejrzewa się źródło w moczu, a oba izolaty E. coli (we krwi iw posiewie moczu) mają ten sam fenotyp (antybiogram).
     2. Klinicznie podejrzewa się źródło/pochodzenie moczu, a posiew moczu jest ujemny, ale pacjent otrzymał co najmniej jedną dawkę ogólnoustrojowego antybiotyku o działaniu przeciwbakteryjnym przeciwko szczepowi E. coli wywołującemu BSI przed uzyskaniem posiewów krwi.
     3. Oba izolaty (we krwi iw posiewie moczu) mają ten sam fenotyp (antybiogram) i nie ma alternatywnego źródła.

   Kryteria wyłączenia:

   1. Stosowanie ogólnoustrojowych antybiotyków przez >48 godzin w ciągu dwóch miesięcy poprzedzających epizod.

   2. Gospodarze z obniżoną odpornością - Pacjenci otrzymujący steroidy ogólnoustrojowe (>10 mg prednizonu/dobę przez 10 lub więcej dni w ciągu ostatnich 2 miesięcy).

      • Pacjenci otrzymujący terapię biologiczną (poprzednie 2 miesiące).
      • Aktywny rak lity lub hematologiczny.
      • HIV+.
      • Neutropenia < 500 PMN/mikrol.

   3. Nieprawidłowości podstawnego układu moczowego lub lokalnie zmodyfikowany mikrobiom pęcherzykowy (dowolny):

      - Ureteroileostomia, ureterosigmoidostomia, ureterostomia (Brickera) lub nefrostomia.

      • Cewnik moczowy założony na stałe (w ciągu ostatnich dwóch miesięcy)
      • Chirurgia urologiczna (w ciągu ostatnich dwóch miesięcy).
      • Chemioterapia dopęcherzowa (w ostatnich dwóch miesiącach).
      • Dopęcherzowe podanie BCG (w ciągu ostatnich dwóch miesięcy).

      Potencjalni kandydaci będą codziennie wykrywani przez mikrobiologów z zespołu badawczego. Kryteria włączenia zostaną zweryfikowane podczas wielodyscyplinarnego spotkania, które zespoły ds. zarządzania środkami przeciwdrobnoustrojowymi (AST) codziennie prowadzą w uczestniczącym szpitalu.

      Szacunkowa wielkość badanej populacji. Dopasowanie:

      - 50 pacjentów ze stosunkiem sepsy/bez sepsy 1:1 zostanie włączonych.

      - Pacjenci z sepsą i bez sepsy zostaną dobrani pod względem płci, wieku (+/- 10 lat), chorób współistniejących (wynik Charlsona +/-1), czasu wystąpienia objawów do posiewu krwi (+/- 24h)

      4.4. Definicje

      Przypadki (posocznica / wstrząs septyczny):

      - Sepsa lub wstrząs septyczny są definiowane jako zagrażająca życiu dysfunkcja narządu spowodowana rozregulowaną odpowiedzią gospodarza na infekcję zgodnie z Międzynarodową Konferencją Definicji Sepsy z 2001 r. SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      Sterownica:

      - Brak sepsy lub wstrząsu septycznego zgodnie z Międzynarodową Konferencją Definicji Sepsy z 2001 r. SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS.

      4.5. Zmienne

      4.5.1. Zmienne związane z pacjentem:

      - Demograficzne: płeć, wiek.

      • Współchorobowość: Zmodyfikowany wskaźnik Charlsona
      • Wyjściowa kreatynina w surowicy.

      4.5.2. Zmienne związane z infekcją.

      - Czas od wystąpienia objawów do rozpoczęcia leczenia przeciwbakteryjnego.

      - Czas od wystąpienia objawów do rozpoczęcia odpowiedniego leczenia przeciwdrobnoustrojowego.

      - Czas od wystąpienia objawów do leczenia chirurgicznego (w razie potrzeby).

      • Nasilenie kliniczne w czasie 0 (posiew krwi) oraz w dniach 2-3 i 30: wynik sepsy.

      4.5.3. Zapalenie, mediatory i biomarkery sepsy. - Następujące biomarkery zostaną określone podczas rejestracji pacjentów: - Liczba i rozróżnienie białych krwinek. - Liczba płytek krwi. - Fibrynogen. - Aktywność protrombiny.

      - Białko reaktywne C.

      • prokalcytonina.
      • GZM A.

      Stężenia GZM A w surowicy będą oznaczane u wszystkich pacjentów podczas wizyty rejestracyjnej, wizyt 2-3 dniowych i 30 dniowych (kinetyka GZM A). Poziomy GZM A zostaną określone za pomocą komercyjnego testu ELISA (zestaw rozwojowy Human Granzyme A ELISA {HRP]; Mabtech).

      Polimorfizm genu GzmA, jak również inne potencjalnie powiązane mutacje, będą badane za pomocą sekwencjonowania całego egzomu (WES). W tym celu wykorzystamy DNA wyizolowane z komórek krwi obwodowej oraz zestaw technologiczny AmpliSeq na platformie Ion Torrent zgodnie z zaleceniami producenta. Ta platforma jest dostępna w Genomics Central Research Unit (CRU) w CIBA z University of Saragossa/IIS Aragon. Wszystkie zestawy do izolacji i analizy próbek DNA są dostępne na rynku i zoptymalizowane przez firmę Thermo Scientific. Analiza bioinformatyczna zostanie przeprowadzona w ramach umowy zawartej pomiędzy Genomics CRU i Micromics SL kierowanej przez Pedro Gonzaleza z CRG w Barcelonie.

      4.5.4. Zmienne mikrobiologiczne

      • Minimalne stężenia hamujące (MIC) izolatów E. coli pobranych z moczu i posiewów krwi zostaną określone za pomocą automatycznych paneli mikrorozcieńczeń, rutynowo wykonywanych przez Laboratorium Mikrobiologiczne uczestniczących szpitali.
      • Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) szczepów E. coli wyizolowanych z posiewów krwi i moczu. Obecność znanych czynników wirulencji E. coli zostanie przeanalizowana i obliczony zostanie wynik wirulencji dla każdego szczepu (Mora-Rillo i in., 2015).