Utilité des lignées cellulaires primaires de glioblastome

Le glioblastome (GBM) est le type le plus agressif de tumeur cérébrale provenant des cellules gliales, représentant 52 % de tous les cas de cancer du cerveau parenchymateux et 20 % de toutes les tumeurs intracrâniennes. Le GBM a une activité mitotique prononcée, une tendance substantielle à la néoangiogenèse (prolifération microvasculaire), une nécrose et des taux de prolifération élevés. En raison de leur nature infiltrante intrinsèque, le GBM a une évolution clinique maligne très agressive. La chimio-radiothérapie (RT) adjuvante avec témozolomide (TMZ) après résection maximale sans danger reste la norme de soins.

Le cancer du cerveau est unique en raison de la "barrière hémato-encéphalique", qui restreint considérablement la circulation sanguine du cerveau. Bien que la barrière hémato-encéphalique (BHE) soit idéale pour protéger le cerveau du danger, lorsque le cerveau contient des cellules cancéreuses, la BHE peut être un problème. Il est donc important de trouver de nouvelles cibles médicamenteuses. Les mécanismes sous-jacents à la radio- et à la chimio-résistance sont mal connus. Des études récentes suggèrent que la régulation à la hausse de la cible moléculaire de la rapamycine (mTOR) joue un rôle central dans la détermination de la résistance au traitement. La régulation à la hausse de mTOR dans le GBM a été rapportée par de multiples découvertes expérimentales et pathologiques. De plus, la régulation à la hausse de mTOR est également la clé de la croissance cellulaire et de la prolifération cellulaire, comme l'ont démontré des études in vivo. En fait, des facteurs spécifiques dérivés des cellules endothéliales cérébrales maintiennent l'expansion des cellules souches du glioblastome via la voie mTOR. La clé du succès du traitement du glioblastome résidera sans aucun doute dans la prise de conscience que cette clinique est une entité en termes biologiques, plus d'une maladie, et qu'il est probable que des thérapies ciblées spécifiques seront efficaces dans des sous-ensembles moléculairement définis. De cette manière, la classification moléculaire de ces tumeurs sera définie en termes cliniquement pertinents sur la base de l'identification de marqueurs qui définissent des sous-ensembles et sont prédictifs de la réponse à des agents prometteurs. Des investigations supplémentaires et l'identification de nouveaux biomarqueurs aideront à mieux définir les sous-types cliniques et biologiques du glioblastome et à améliorer le contrôle de la maladie. En bref, la tumeur cérébrale a des mutations ad personam particulières. C'est pourquoi les investigateurs ont décidé de mettre en place des lignes primaires à partir de la biopsie du patient.

Résultats attendus du projet de recherche scientifique :

Dans le premier cas, le résultat principal sera d'établir des cultures cellulaires et des cellules souches qui reproduisent fidèlement in vitro la physiologie de la tumeur en conservant les mêmes caractéristiques que le néoplasme du patient.

1. Évaluer l'effet de nouveaux médicaments cibles sur la prolifération des lignées cellulaires primaires et continues de glioblastome humain en établissant des courbes de croissance et des tests de toxicité du méthyl thiazolyl tétrazolium (MTT).
2. Criblage de médicaments naturels et synthétiques à l'aide de lignées cellulaires primaires de glioblastome dérivées de patients
3. Caractériser les mécanismes et les protéines impliquées dans la voie apoptotique et/ou autophagique avec des tests d'immunohistochimie et de western blot dans des cellules témoins et traitées.
4. Validation de cibles moléculaires précédemment identifiées dans des modèles précliniques de cancers du cerveau. Les chercheurs sont en mesure d'identifier de nouveaux déterminants moléculaires qui peuvent être ciblés par une intervention pharmacologique pour diminuer ou bloquer la croissance tumorale.

matériaux et méthodes

Prélèvement et cryoconservation d'échantillons tumoraux

Des spécimens de résection de tumeurs de glioblastome (GBM) (n = 20) ont été reçus stériles et fraîchement de Neuromed Neurosurgery. Des échantillons de tissu tumoral ont été congelés instantanément dans de l'azote liquide et stockés en phase gazeuse au-dessus de l'azote liquide. De plus, des cubes de tissu tumoral (3 × 3 × 3 mm) ont été congelés de manière vitale. Pour cette procédure, des morceaux de tumeur ont été coupés avec une lame de scalpel stérile, et 4 morceaux de tumeur ont été transférés dans un cryo-tube stérile dans 1,5 ml de milieu de congélation (sérum de veau fœtal contenant 10 % de DMSO), scellé dans un récipient de congélation (Nalgene, Rochester , USA), et placés immédiatement à -80°C. Jusqu'à décongélation, les tubes ont été conservés à -80°C (pendant au maximum 6 semaines) ou, après une nuit de refroidissement, transférés dans un réservoir d'azote (pour des périodes de stockage plus longues).

Cohorte de patients

Des échantillons cliniques de 5 patients atteints de GBM de grade IV de l'OMS et de 3 patients atteints d'un astrocytome récidivant, de grade III de l'OMS et d'un patient atteint d'oligodendrogliome de grade III (tableau 1) ont été prélevés dans le service de neurochirurgie de Neuromed IRCCS. Le consentement préalable éclairé a été obtenu.

Culture tissulaire et établissement de lignées cellulaires

Avec le consentement écrit des patients et/ou conformément aux directives institutionnelles, immédiatement après la résection, prélever des échantillons de tumeur (200 à 500 mg de tumeur sont recommandés) dans un tube contenant un milieu de cellules souches stérile froid sans facteurs de croissance. Transportez immédiatement l'échantillon vers la hotte de culture tissulaire pour le traitement.

Pour les chirurgies sur un site distant, coupez l'échantillon de tumeur en fragments plus petits et placez-le dans un tube contenant des milieux de cellules souches stériles froids sans facteurs de croissance (garder sur la glace) pour le transport. La tumeur peut être traitée dans les 2-3 heures suivant la résection. Des échantillons de tumeur provenant d'un modèle animal préclinique de tumeur GBM humaine peuvent également être collectés et traités de la même manière.

Dans la hotte à flux laminaire BSL II stérile, placez la tumeur dans une boîte de Pétri de 35 mm avec 3 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Laver le spécimen de tumeur (2 à 3 fois) en les transférant séquentiellement dans de nouveaux plats de 35 mm remplis de 5 ml de HBSS pour éliminer le sang et les débris. Aspirez le HBSS excessif du plat. Couper immédiatement la tumeur en petits fragments et hacher avec une lame de scalpel stérile en fragments d'environ 1 mm3. Le meilleur rendement peut être obtenu lorsque les tumeurs sont hachées en très petits morceaux. Ajouter 3 ml de mélange de digestion enzymatique (collagenaseD/DNase 1) au tissu haché et recueillir le tissu haché avec une pipette jetable de 5 ml, pipetage de haut en bas à quelques reprises. Ensuite, transférez les fragments de tumeur dans 30 ml de mélange de digestion enzymatique préchauffé. La concentration finale des enzymes doit être de 1 mg de collagénase D et de 0,1 mg de DNase I par millilitre de HBSS. Après digestion, les cellules individuelles des tissus ont été lavées et étalées. Les lignées cellulaires ont été identifiées avec les premières lettres du nom et du prénom du patient.

Cinétique de croissance

Les cellules (5 × 10 ^ 5 cellules) ont été étalées dans 5 ml de milieu en quintuplicate dans des flacons de culture T25 par lignée cellulaire et laissées se fixer pendant 48 h; les cellules vitales ont été évaluées par coloration au bleu trypan et un flacon a été compté toutes les 24 h pendant cinq jours consécutifs à l'aide d'une chambre de Neubauer.

Analyse de la méthylation du promoteur O6-méthylguanine-ADN-méthyltransférase (MGMT)

Pour analyser le promoteur MGMT concernant la méthylation, la méthode MethyLight a été appliquée. En bref, l'ADN génomique (ADNg) a été soumis à une conversion au bisulfite à l'aide du kit Epitect Bisulfite (Qiagen, Hilden, Allemagne) conformément aux recommandations du fabricant. Une combinaison amorce/sonde spécifique de la séquence du promoteur MGMT méthylé a été utilisée (sens : 5'-GCGTTTTCGACGTTCGTAGGT-3' ; sens inverse : 5'-CACTCTTCCGAAAACGAAACG-3' ; sonde : 5'-6FAM-CGCAAACGATACGCACCGCGA-TMR-3'), avec Kit de sonde SensiFast (Bioline, Luckenwalde, Allemagne). L'ADN traité à la cytosine-phosphate-guanosine (CpG) méthylase (SssI) a servi d'étalon, car il est considéré comme entièrement méthylé. Le gène de la collagénase 2A1 (COL2A1) a été utilisé comme contrôle endogène (sens : 5'-TCTAACAATTATAAACTCCAACCACCAA-3' ; sens inverse : 5'-GGGAAGATGGGATAGAAGGGAATAT-3' ; sonde : 5'-6FAM-CCTTCATTCTAACCCAATACCTATCCCACCTCTAAA-TMR-3'). Le pourcentage de valeur de référence méthylée (PMR) a été calculé en divisant le rapport MGMT/COL2A1 de l'échantillon par le rapport MGMT/COL2A1 de l'ADN traité par SssI, et en multipliant par 100. Les échantillons avec une valeur PMR > 4 ont été considérés comme méthylés. Toutes les réactions ont été réalisées en triple.

Analyses de mutation

Les échantillons ont subi des analyses pour les loci suivants : IDH1 R132 (exon 4), IDH2 R172 (exon 4), B-Raf V600 (exon 15), K-Ras G12, G13 (exon 2) et Q61 (exon 3) et exons TP53 5 à 8. Les régions génomiques désirées ont été amplifiées par PCR en utilisant des amorces spécifiques. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été réalisée à l'aide de la polymérase MyTaqHS (Bioline) selon les recommandations du fabricant. La réaction PCR a été contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose et 15 µl des produits ont été purifiés en utilisant 3 unités de FAST AP™ Alkaline Phosphatase (Fermentas, St. Leon-Rot, Allemagne) et 30U d'Exonucléase I (Fermentas) par incubation à 37° C pendant 15 min et ensuite inactivation par la chaleur à 85°C pendant 15 min.

Taux de réussite

L'investigateur a évalué les taux d'attachement et d'excroissance de 2 échantillons consécutifs de tumeur GBM de grade IV de l'OMS et de deux astrocytomes en rechute, lorsqu'ils ont été préparés frais directement après la résection (culture n ° 4). Après préparation fraîche, les cellules se sont attachées dans 100% des cas. Les quatre paires de cultures cellulaires à croissance externe les plus rapides et les plus stables ont ensuite été caractérisées en détail. Dans ce qui suit, les cultures stables (pouvant être repiquées > 10 fois) sont appelées lignées cellulaires. Les lignées cellulaires issues de matériel frais ont été marquées des initiales du nom et du prénom du patient afin de garantir l'anonymat tout en respectant la vie privée du patient.

Immunohistochimie

Une lignée cellulaire représentative de chaque tumeur a été colorée par immunohistochimie pour Ki67 (indice de prolifération estimé en pourcentage (%) de cellules positives dans un champ de 100), IDH1, ATRX (marqueurs de tumeurs cérébrales) et GFAP (marqueur glial) (Ventana, Tucson, Arizona) a été réalisée automatiquement avec un instrument Nexes (Ventana). La détection des anticorps a été réalisée à l'aide d'une méthode de complexe streptavidine-biotine à liaisons multiples, et les anticorps ont été visualisés par une méthode de chromagène à la diaminobenzidine. Les échantillons de contrôle négatifs ont été incubés avec des anticorps primaires uniquement.

Résultats

Tableau 1

Lignée cellulaire Vimentine GFAP Atrx IDH1 MET

COGI + + + FE +

CL + + + - -

CG + FE + - +

PAP + + + + +

ADN + FE + - -

DRA + + + FE -

ZAR 67/19 + FE + - -

VEM + + + + +

AD + - + - +

IP + FE + - -

Sur ces cultures cellulaires établies, de nouvelles substances, y compris des substances naturelles, seront testées et utilisées comme substances adjuvantes pour la thérapie traditionnelle avec Temodal. Dans ce projet, le chercheur a l'intention d'utiliser l'acide coumarique.

1. Évaluer l'effet de l'acide coumarique sur la prolifération des cellules de glioblastome humain : lignées primaires et continues ;
2. Étudier les mécanismes déclenchés par l'acide coumarique dans la cellule néoplasique pour bloquer sa croissance. Analyser l'expression des protéines régulatrices du cycle cellulaire dans les cellules de glioblastome humain après traitement avec de l'acide coumarique à différentes concentrations.
3. Évaluer la croissance des cellules de glioblastome humain dans un modèle animal (souris CD1 nues inoculées avec une lignée continue de cellules de glioblastome humain U87MG) et après traitement à l'acide coumarique.