Utilidade de Linhagens Celulares de Glioblastoma Primário

Glioblastoma (GBM) é o tipo mais agressivo de tumor cerebral originário de células gliais, representando 52% de todos os casos de câncer de parênquima cerebral e 20% de todos os tumores intracranianos. O GBM tem atividade mitótica pronunciada, tendência substancial à neoangiogênese (proliferação microvascular), necrose e altas taxas proliferativas. Devido à sua natureza infiltrativa intrínseca, o GBM tem um curso clínico maligno altamente agressivo. A quimiorradioterapia (RT) adjuvante com temozolomida (TMZ) após ressecção segura máxima continua sendo o padrão de atendimento.

O câncer cerebral é único por causa da "barreira hematoencefálica", que restringe severamente a corrente sanguínea do cérebro. Embora a barreira hematoencefálica (BHE) seja ótima para proteger o cérebro do perigo, quando o cérebro tem células cancerígenas, a BHE pode ser um problema. Portanto, é importante encontrar novos alvos de drogas. Os mecanismos subjacentes à radio e quimiorresistência são pouco compreendidos. Estudos recentes sugerem que a regulação positiva do alvo molecular da rapamicina (mTOR) desempenha um papel fundamental na determinação da resistência ao tratamento. A regulação positiva de mTOR no GBM foi relatada por vários achados experimentais e patológicos. Além disso, a regulação positiva de mTOR também é a chave para o crescimento e proliferação celular, conforme demonstrado por estudos in vivo. De fato, fatores específicos derivados de células endoteliais cerebrais mantêm a expansão de células-tronco de glioblastoma através da via mTOR. A chave para o sucesso do tratamento do glioblastoma estará, sem dúvida, na percepção de que esta clínica é uma entidade em termos biológicos, mais de uma doença, e é provável que terapias direcionadas específicas sejam eficazes em subconjuntos definidos molecularmente. Desta forma, a classificação molecular destes tumores será definida em termos clinicamente relevantes com base na identificação de marcadores que definem subconjuntos e são preditivos de resposta a agentes promissores. Investigações adicionais e identificações de novos biomarcadores ajudarão a definir melhor os subtipos clínicos e biológicos de glioblastoma e um melhor controle da doença. Em suma, o tumor cerebral tem mutações ad personam peculiares. É por isso que os investigadores decidiram estabelecer linhas primárias a partir da biópsia do paciente.

Resultados esperados do projeto de pesquisa científica:

Em primeira instância, o resultado primário será estabelecer culturas de células e células-tronco que reproduzam fielmente in vitro a fisiologia do tumor mantendo as mesmas características da neoplasia do paciente

1. Avaliar o efeito de novas drogas-alvo na proliferação de linhas celulares de glioblastoma humano primário e contínuo, estabelecendo curvas de crescimento e ensaios de toxicidade de metil tiazolil tetrazólio (MTT).
2. Triagem de drogas naturais e sintéticas usando linhagens celulares de glioblastoma primário derivadas de pacientes
3. Caracterizar os mecanismos e proteínas envolvidas na via apoptótica e/ou autofágica com imuno-histoquímica e ensaios de western blot em células controle e tratadas.
4. Validação de alvos moleculares previamente identificados em modelos pré-clínicos de câncer cerebral. Os investigadores são capazes de identificar novos determinantes moleculares que podem ser alvo de intervenção farmacológica para diminuir ou bloquear o crescimento do tumor.

materiais e métodos

Coleta e Criopreservação de Amostras de Tumores

Espécimes de ressecção de tumores de glioblastoma (GBM) (n = 20) foram recebidos estéreis e frescos da Neuromed Neurosurgery. As amostras de tecido tumoral foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas na fase gasosa acima do nitrogênio líquido. Além disso, cubos de tecido tumoral (3 × 3 × 3 mm) foram congelados vitalmente. Para este procedimento, pedaços de tumor foram cortados com uma lâmina de bisturi estéril e 4 pedaços de tumor foram transferidos para um criotubo estéril em 1,5 ml de meio de congelamento (soro fetal de vitela contendo 10% de DMSO), selado em um recipiente de congelamento (Nalgene, Rochester , EUA) e colocados imediatamente a -80 ° C. Até o descongelamento, os tubos foram mantidos a -80 ° C (por no máximo 6 semanas) ou, após resfriamento noturno, transferidos para tanque de nitrogênio (para períodos de armazenamento mais longos).

Coorte de pacientes

Amostras clínicas de 5 pacientes com GBM grau IV da OMS e 3 pacientes com Astrocitoma recidivante, grau III da OMS e um com oligodendroglioma grau III (Tabela 1) foram coletadas do departamento de Neurocirurgia do Neuromed IRCCS. Foi obtido consentimento informado prévio.

Cultura de Tecidos e Estabelecimento de Linhagem Celular

Com o consentimento por escrito dos pacientes e/ou de acordo com as diretrizes institucionais, imediatamente após a ressecção, colete amostras de tumor (recomenda-se 200-500 mg de tumor) em um tubo contendo meio de célula-tronco estéril frio sem fatores de crescimento. Transporte a amostra imediatamente para a capela de cultura de tecidos para processamento.

Para cirurgias em um local remoto, corte a amostra do tumor em fragmentos menores e coloque em um tubo contendo mídia de células-tronco estéril fria sem fatores de crescimento (mantenha no gelo) para transporte. O tumor pode ser processado dentro de 2-3 horas após a ressecção. As amostras de tumor de um modelo animal pré-clínico de tumor GBM humano também podem ser coletadas e processadas da mesma maneira.

Na capela de fluxo laminar BSL II estéril, coloque o tumor em uma placa de Petri de 35 mm com 3 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS). Lave a amostra do tumor (2 a 3 vezes) transferindo-a sequencialmente para novas placas de 35 mm preenchidas com 5 mL de HBSS para remover sangue e detritos. Aspire o excesso de HBSS do prato. Corte imediatamente o tumor em pequenos fragmentos e pique com uma lâmina de bisturi estéril em fragmentos de aproximadamente 1 mm3. O melhor rendimento pode ser alcançado quando os tumores são picados em pedaços muito pequenos. Adicione 3 mL da mistura de digestão enzimática (colagenaseD/DNase 1) ao tecido picado e colete o tecido picado com uma pipeta descartável de 5 mL, pipetando para cima e para baixo algumas vezes. Em seguida, transfira os fragmentos do tumor para 30 mL de mistura de digestão enzimática pré-aquecida. A concentração final de enzimas deve ser de 1 mg de colagenase D e 0,1 mg de DNase I por mililitro de HBSS. Após a digestão, as células individuais do tecido foram lavadas e plaqueadas. As linhagens celulares foram identificadas com as primeiras letras do nome e sobrenome do paciente.

Cinética de crescimento

As células (5 × 10 ^ 5 células) foram plaqueadas em 5 ml de meio em quintuplicata em frascos de cultura T25 por linha celular e deixadas em contato por 48 h; as células vitais foram avaliadas pela coloração com azul de tripano e um frasco foi contado a cada 24 horas por cinco dias consecutivos usando uma câmara de Neubauer.

Análise de metilação do promotor de O6-metilguanina-DNA-metiltransferase (MGMT)

Para analisar o promotor MGMT em relação à metilação, foi aplicado o método MethyLight. Resumidamente, o DNA genômico (gDNA) foi submetido à conversão bissulfito usando o Epitect Bisulfite Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as recomendações do fabricante. Foi utilizada uma combinação primer/sonda específica para a sequência do promotor MGMT metilado (avanço: 5'-GCGTTTCGACGTTCGTAGGT-3'; reverso: 5'-CACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'; sonda: 5'-6FAM-CGCAAACGATACGCACCGCGA-TMR-3'), com SensiFast Probe Kit (Bioline, Luckenwalde, Alemanha). DNA tratado com citosina-fosfato-guanosina (CpG) Metilase (SssI) serviu como calibrador, pois é considerado totalmente metilado. O gene da colagenase 2A1 (COL2A1), foi usado como controle endógeno (avanço: 5'-TCTAACAATTATAAACTCCAACCACCAA-3'; reverso: 5'-GGGAAGATGGGATAGAAGGGAATAT-3'; sonda: 5'-6FAM-CCTTCATTCTAACCCAATACCTATCCCACCTCTAAA-TMR-3'). A porcentagem do valor de referência metilado (PMR) foi calculada dividindo a razão MGMT/COL2A1 da amostra pela razão MGMT/COL2A1 do DNA tratado com SssI e multiplicando por 100. Amostras com valor de PMR >4 foram consideradas metiladas. Todas as reações foram realizadas em triplicata.

Análises de mutação

As amostras foram submetidas a análises para os seguintes loci: IDH1 R132 (exon 4), IDH2 R172 (exon 4), B-Raf V600 (exon 15), K-Ras G12, G13 (exon 2) e Q61 (exon 3) e exons TP53 5 a 8. As regiões genômicas desejadas foram amplificadas por PCR usando primers específicos. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada utilizando a polimerase MyTaqHS (Bioline) de acordo com as recomendações do fabricante. A reação de PCR foi controlada por eletroforese em gel de agarose e 15 µl dos produtos foram purificados usando 3 unidades de FAST AP™ Fosfatase Alcalina (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) e 30U de Exonuclease I (Fermentas) por incubação a 37° C por 15 min e subsequente inativação por calor a 85°C por 15 min.

Taxas de sucesso

O investigador avaliou as taxas de adesão e crescimento de 2 amostras consecutivas de tumor GBM grau IV da OMS e dois astrocitomas recidivantes, quando preparados frescos diretamente após a ressecção (cultura #4). Após a preparação a fresco, as células aderiram em 100% dos casos. Os quatro pares de culturas de células de crescimento mais rápido e estável foram subsequentemente caracterizados em detalhes. A seguir, as culturas de superação estáveis ​​(podem ser passadas > 10 vezes) são denominadas linhas celulares. Linhagens celulares derivadas de material fresco foram marcadas com as iniciais do nome e sobrenome do paciente para garantir o anonimato, respeitando a privacidade do paciente.

imuno-histoquímica

Linhagens celulares representativas de cada tumor foram coradas por imuno-histoquímica para Ki67 (índice de proliferação estimado como uma porcentagem (%) de células positivas em um campo de 100), IDH1, ATRX (marcadores de tumores cerebrais) e GFAP (marcador glial) (Ventana, Tucson, Arizona) foi realizada automaticamente com um instrumento Nexes (Ventana). A detecção de anticorpos foi realizada usando um método de complexo multilink estreptavidina-biotina, e os anticorpos foram visualizados por um método de diaminobenzidina chromagen. As amostras de controle negativo foram incubadas apenas com anticorpos primários.

Resultados

tabela 1

Linha celular Vimentina GFAP Atrx IDH1 MET

CGI + + + FE +

CL + + + - -

CG + FE + - +

PAP + + + + +

ADN + FE + - -

DRA + + + FE -

ZAR 67/19 + FE + - -

VEM + + + + +

DE + - + - +

IP + FE + - -

Nestas culturas de células estabelecidas, novas substâncias, incluindo substâncias naturais, serão testadas e utilizadas como substâncias adjuvantes para a terapia tradicional com Temodal. Neste projeto o investigador pretende utilizar o ácido cumárico.

1. Avaliar o efeito do ácido cumárico na proliferação de células de glioblastoma humano: linhas primárias e contínuas;
2. Investigar os mecanismos desencadeados pelo ácido cumárico na célula neoplásica para bloquear seu crescimento. Analisar a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular em células de glioblastoma humano após tratamento com ácido cumárico em várias concentrações.
3. Avaliar o crescimento de células de glioblastoma humano em modelo animal (camundongos CD1 nus inoculados com uma linha contínua de células U87MG de glioblastoma humano) e após tratamento com ácido cumárico.