Użyteczność pierwotnych linii komórkowych glejaka wielopostaciowego

Glioblastoma (GBM) jest najbardziej agresywnym typem guza mózgu wywodzącym się z komórek glejowych, stanowiącym 52% wszystkich przypadków raka miąższu mózgu i 20% wszystkich guzów wewnątrzczaszkowych. GBM ma wyraźną aktywność mitotyczną, znaczną tendencję do neoangiogenezy (proliferacji mikrokrążenia), martwicy i wysokiego tempa proliferacji. Ze względu na ich wrodzoną naciekową naturę, GBM ma bardzo agresywny złośliwy przebieg kliniczny. Standardem postępowania pozostaje adiuwantowa chemio-radioterapia (RT) temozolomidem (TMZ) po maksymalnie bezpiecznej resekcji.

Rak mózgu jest wyjątkowy ze względu na „barierę krew-mózg”, która poważnie ogranicza przepływ krwi do mózgu. Podczas gdy bariera krew-mózg (BBB) ​​doskonale chroni mózg przed niebezpieczeństwem, gdy w mózgu znajdują się komórki nowotworowe, bariera BBB może stanowić problem. Dlatego ważne jest znalezienie nowych celów dla leków. Mechanizmy leżące u podstaw oporności na promieniowanie i chemioterapię są słabo poznane. Ostatnie badania sugerują, że regulacja w górę celu molekularnego rapamycyny (mTOR) odgrywa kluczową rolę w określaniu oporności na leczenie. Regulacja w górę mTOR w GBM została opisana w wielu badaniach eksperymentalnych i patologicznych. Co więcej, regulacja w górę mTOR jest również kluczem do wzrostu i proliferacji komórek, jak wykazano w badaniach in vivo. W rzeczywistości specyficzne czynniki pochodzące z komórek śródbłonka mózgu utrzymują ekspansję komórek macierzystych glejaka poprzez szlak mTOR. Kluczem do skutecznego leczenia glejaka będzie bez wątpienia uświadomienie sobie, że ta klinika jest podmiotem w kategoriach biologicznych, więcej niż jedną chorobą i jest prawdopodobne, że określone terapie celowane będą skuteczne w molekularnie zdefiniowanych podgrupach. W ten sposób klasyfikacja molekularna tych nowotworów zostanie zdefiniowana za pomocą klinicznie istotnych terminów w oparciu o identyfikację markerów, które definiują podzbiory i przewidują odpowiedź na obiecujące czynniki. Dodatkowe badania i identyfikacja nowych biomarkerów pomogą lepiej zdefiniować kliniczne i biologiczne podtypy glejaka oraz udoskonalić kontrolę choroby. Krótko mówiąc, guz mózgu ma specyficzne mutacje ad personam. Dlatego badacze postanowili założyć podstawowe linie rozpoczynające się od biopsji pacjenta.

Przewidywane rezultaty projektu naukowo-badawczego:

W pierwszej kolejności głównym rezultatem będzie stworzenie hodowli komórkowych i komórek macierzystych, które wiernie odtwarzają in vitro fizjologię guza zachowując te same cechy nowotworu pacjenta

1. Oceń wpływ nowych leków docelowych na proliferację pierwotnych i ciągłych linii komórkowych ludzkiego glejaka poprzez utworzenie krzywych wzrostu i testów toksyczności metylotiazolilotetrazolu (MTT).
2. Badania przesiewowe leków naturalnych i syntetycznych przy użyciu linii komórkowych glejaka pierwotnego pochodzących od pacjentów
3. Scharakteryzuj mechanizmy i białka zaangażowane w szlak apoptotyczny i / lub autofagiczny za pomocą testów immunohistochemicznych i Western blot w komórkach kontrolnych i traktowanych.
4. Walidacja wcześniej zidentyfikowanych celów molekularnych w przedklinicznych modelach nowotworów mózgu. Badacze są w stanie zidentyfikować nowe determinanty molekularne, które mogą być celem interwencji farmakologicznej w celu zmniejszenia lub zablokowania wzrostu guza.

Materiały i metody

Pobieranie próbek guza i kriokonserwacja

Wycięte próbki guzów glejaka wielopostaciowego (GBM) (n = 20) otrzymano w stanie jałowym i świeżo z Neuromed Neurosurgery. Próbki tkanki nowotworowej szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w fazie gazowej powyżej ciekłego azotu. Dodatkowo kostki tkanki guza (3 × 3 × 3 mm) zostały żywotnie zamrożone. W tej procedurze kawałki guza pocięto sterylnym ostrzem skalpela, a 4 kawałki guza przeniesiono do sterylnej krioprobówki w 1,5 ml pożywki do zamrażania (płodowa surowica cielęca zawierająca 10% DMSO), szczelnie zamkniętą w pojemniku do zamrażania (Nalgene, Rochester , USA) i natychmiast umieszczano w temperaturze -80°C. Do czasu rozmrożenia probówki trzymano w temperaturze -80°C (maksymalnie 6 tygodni) lub po schłodzeniu przez noc przenoszono do zbiornika z azotem (na dłuższe okresy przechowywania).

Kohorta pacjentów

Próbki kliniczne od 5 pacjentów z GBM stopnia IV wg WHO i od 3 pacjentów z nawrotowym gwiaździakiem stopnia III według WHO i jednego ze skąpodrzewiakiem stopnia III (tabela 1) pobrano z oddziału neurochirurgii w Neuromed IRCCS. Uzyskano zgodę po uprzednim poinformowaniu.

Hodowla tkankowa i ustanowienie linii komórkowej

Za pisemną zgodą pacjentów i/lub zgodnie z wytycznymi instytucji, bezpośrednio po resekcji należy pobrać próbki guza (zaleca się 200-500 mg guza) do probówki zawierającej zimne, sterylne pożywki komórek macierzystych bez czynników wzrostu. Natychmiast przetransportuj próbkę do wyciągu do hodowli tkankowej w celu przetworzenia.

W przypadku operacji w odległym miejscu pokrój próbkę guza na mniejsze fragmenty i umieść w probówce zawierającej zimną sterylną pożywkę dla komórek macierzystych bez czynników wzrostu (przechowywać w lodzie) na czas transportu. Guz można leczyć w ciągu 2-3 godzin po resekcji. Próbki guza z przedklinicznego modelu zwierzęcego ludzkiego guza GBM można również zbierać i przetwarzać w ten sam sposób.

Pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym BSL II umieścić guza na szalce Petriego o średnicy 35 mm z 3 ml zrównoważonego roztworu soli Hanka (HBSS). Wypłucz próbkę guza (2 do 3 razy), przenosząc ją kolejno do nowych szalek o średnicy 35 mm wypełnionych 5 ml HBSS w celu usunięcia krwi i zanieczyszczeń. Odessać nadmiar HBSS z szalki. Natychmiast pociąć guz na małe fragmenty i posiekać sterylnym ostrzem skalpela na kawałki o wielkości około 1 mm3. Najlepszą wydajność można osiągnąć, gdy guzy zostaną posiekane na bardzo małe kawałki. Dodaj 3 ml mieszaniny do trawienia enzymatycznego (kolagenaza D/DNaza 1) do zmielonej tkanki i zbierz zmieloną tkankę za pomocą 5 ml jednorazowej pipety, kilka razy pipetując w górę iw dół. Następnie przenieść fragmenty guza do 30 ml ogrzanej wcześniej mieszaniny do trawienia enzymatycznego. Końcowe stężenie enzymów powinno wynosić 1 mg kolagenazy D i 0,1 mg DNazy I na mililitr HBSS. Po wytrawieniu tkanki pojedyncze komórki przemywano i wysiewano na płytki. Linie komórkowe identyfikowano na podstawie pierwszych liter imienia i nazwiska pacjenta.

Kinetyka wzrostu

Komórki (5 x 10^5 komórek) wysiano w 5 ml pożywki w pięciokrotnych powtórzeniach w kolbach do hodowli T25 na linię komórkową i pozostawiono do przyczepienia na 48 godzin; żywe komórki oceniano przez barwienie błękitem trypanu i zliczano jedną kolbę co 24 godziny przez pięć kolejnych dni, stosując komorę Neubauera.

Analiza metylacji promotora O6-metyloguaniny-DNA-metylotransferazy (MGMT).

Do analizy promotora MGMT pod kątem metylacji zastosowano metodę MethyLight. W skrócie, genomowy DNA (gDNA) poddano konwersji wodorosiarczynem przy użyciu zestawu Epitect Bisulfite Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z zaleceniami producenta. Zastosowano kombinację starter/sonda specyficzną dla metylowanej sekwencji promotora MGMT (przód: 5'-GCGTTTCGACGTTCGTAGGT-3'; tył: 5'-CACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'; sonda: 5'-6FAM-CGCAAACGATACGCACCGCGA-TMR-3'), z Zestaw sondy SensiFast (Bioline, Luckenwalde, Niemcy). DNA potraktowane cytozyno-fosforanem-guanozyną (CpG) metylazą (SssI) służyło jako kalibrator, ponieważ uważa się, że jest w pełni zmetylowane. Gen kolagenazy 2A1 (COL2A1) zastosowano jako kontrolę endogenną (przód: 5'-TCTAACAATTATAAACTCCAACCACCAA-3'; tył: 5'-GGGAAGATGGGGATAGAAGGGAATAT-3'; sonda: 5'-6FAM-CCTTCATTCTAACCCAATACCTATCCCACCTCTAAA-TMR-3'). Wartość procentową metylowanej wartości referencyjnej (PMR) obliczono dzieląc stosunek MGMT/COL2A1 w próbce przez stosunek MGMT/COL2A1 w DNA traktowanym SssI i mnożąc przez 100. Próbki o wartości PMR >4 uznano za metylowane. Wszystkie reakcje przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

Analizy mutacji

Próbki poddano analizie dla następujących loci: IDH1 R132 (ekzon 4), IDH2 R172 (ekzon 4), B-Raf V600 (ekson 15), K-Ras G12, G13 (ekson 2) i Q61 (ekson 3) oraz eksony TP53 5 do 8. Pożądane regiony genomowe zamplifikowano metodą PCR przy użyciu specyficznych starterów. Łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) przeprowadzono stosując polimerazę MyTaqHS (Bioline) zgodnie z zaleceniami producenta. Reakcję PCR kontrolowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i 15 µl produktów oczyszczono przy użyciu 3 jednostek fosfatazy alkalicznej FAST AP™ (Fermentas, St. Leon-Rot, Niemcy) i 30 U egzonukleazy I (Fermentas) przez inkubację w temperaturze 37°C C przez 15 min, a następnie inaktywacja termiczna w 85°C przez 15 min.

Wskaźniki sukcesu

Badacz ocenił tempo przyczepu i wzrostu 2 kolejnych próbek guza GBM stopnia IV wg WHO i dwóch gwiaździaków z nawrotem choroby, przygotowanych na świeżo bezpośrednio po resekcji (hodowla nr 4). Po świeżym preparacie komórki przylegały w 100% przypadków. Następnie szczegółowo scharakteryzowano cztery najszybciej i stabilnie wyrastające pary hodowli komórkowych. Poniżej, stabilnie rosnące hodowle (mogące być pasażowane >10 razy) są nazywane liniami komórkowymi. Linie komórkowe pochodzące ze świeżego materiału oznaczono inicjałami imienia i nazwiska pacjenta, aby zapewnić anonimowość przy poszanowaniu prywatności pacjenta.

Immunohistochemia

Reprezentatywną linię komórkową każdego guza barwiono metodą immunohistochemiczną pod kątem Ki67 (wskaźnik proliferacji oszacowany jako (%) odsetek komórek dodatnich w polu 100), IDH1, ATRX (markery guzów mózgu) i GFAP (marker glejowy) (Ventana, Tucson, Arizona) przeprowadzono automatycznie za pomocą instrumentu Nexes (Ventana). Wykrywanie przeciwciał przeprowadzono stosując metodę kompleksu streptawidyna-biotyna typu multilink, a przeciwciała wizualizowano metodą chromagenu diaminobenzydyny. Próbki kontroli ujemnej inkubowano wyłącznie z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Wyniki

Tabela 1

Linia komórkowa Wimentyna GFAP Atrx IDH1 MET

COGI + + + FE +

CL + + + - -

CG + FE + - +

PAP + + + + +

DNA + FE + - -

DRA + + + FE -

ZAR 67/19 + FE + - -

VEM + + + + +

DA + - + - +

IP + FE + - -

Na tych ustalonych kulturach komórkowych nowe substancje, w tym substancje naturalne, będą testowane i stosowane jako substancje wspomagające w tradycyjnej terapii Temodalem. W tym projekcie badacz zamierza wykorzystać kwas kumarowy.

1. Ocena wpływu kwasu kumarowego na proliferację ludzkich komórek glejaka: linie pierwotne i ciągłe;
2. Zbadaj mechanizmy uruchamiane przez kwas kumarowy w komórce nowotworowej, aby zablokować jej wzrost. Analiza ekspresji białek regulatorowych cyklu komórkowego w ludzkich komórkach glejaka wielopostaciowego po leczeniu kwasem kumarowym w różnych stężeniach.
3. Ocenić wzrost ludzkich komórek glejaka w modelu zwierzęcym (nagie myszy CD1 zaszczepione ciągłą linią ludzkich komórek glejaka U87MG) i po traktowaniu kwasem kumarowym.