Potenziale diagnostico del DNA ipermetilato nel cancro colorettale

Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle forme più comuni di cancro e la seconda causa di decessi correlati al cancro nel mondo occidentale, rappresentando la morte annuale di 215.000 europei nel 2012 e circa 50.310 americani nel 2014.

Il CRC sporadico si sviluppa attraverso l'accumulo di alterazioni genetiche ed epigenetiche nel rivestimento cellulare epiteliale. Si pensa che queste alterazioni spingano le normali cellule epiteliali nella sequenza adenoma-carcinoma. Il rilevamento del DNA ipermetilato può essere effettuato nel sangue o nelle feci di pazienti oncologici e si ritiene che il DNA privo di cellule ipermetilato nel sangue e nelle feci possa essere utilizzato come biomarcatore del cancro, esibendo un'elevata sensibilità e specificità nel CRC e in altri principali tipi di cancro (per esempio. cancro del polmone, della prostata e della mammella).

Il DNA privo di cellule ipermetilato - misurato nel plasma - potrebbe rivelarsi un biomarcatore più specifico e sensibile per il CRC rispetto sia alla rilevazione del sangue nelle feci che al CEA nel sangue dei pazienti con CRC.

Gli obiettivi di questo progetto sono esaminare se l'ipermetilazione di geni specifici misurati dal DNA privo di cellule nel plasma di pazienti con CRC sia un biomarcatore diagnostico per CRC. I risultati di questo studio mostreranno se un singolo campione di sangue può differenziare i pazienti con CRC dai pazienti senza cancro.

Lo sviluppo di un biomarcatore affidabile, sensibile e specifico per CRC migliorerà immensamente la diagnostica e la gestione dei pazienti con CRC.

Per proporre le regioni promotrici del DNA ipermetilato più sensibili e specifiche per il rilevamento di CRC, sarà intrapresa una revisione della letteratura attualmente disponibile. Verranno utilizzati i seguenti criteri di ricerca (termini MeSH): "neoplasia colorettale", "metilazione del DNA o isole CpG", "campione di tumore o feci o sangue o siero o plasma", "real time PCR o analisi di microarray o sequenziamento del genoma o biopsia o analisi del sangue". Sulla base di questa revisione verrà scritta una revisione della letteratura: "DNA Methylation in Blood and Stool as a Screening and Prognostic Marker for Colorectal Cancer".

L'epigenetica è lo studio dei cambiamenti ereditabili nell'espressione genica, che non si verificano a causa di cambiamenti nella sequenza del DNA. Le alterazioni epigenetiche includono l'instabilità dei microsatelliti, le modificazioni degli istoni e la metilazione del DNA. La metilazione del DNA è un fenomeno normale nelle cellule eucariotiche e si verifica in tutto il genoma. La metilazione mira ai residui di citosina seguiti da una guanina sul filamento di DNA (chiamato isole CpG) che li converte in metil-citosina. Le isole CpG non metilate esistono in un'alta concentrazione nelle regioni del promotore dei geni umani e l'ipermetilazione del promotore del DNA porta a una ridotta attività trascrizionale. Questo evento si verifica nei soppressori tumorali portando al silenziamento genico che è correlato alla genesi del tumore. L'ipermetilazione dell'isola CpG ha dimostrato di essere un processo non casuale e il modello di ipermetilazione genica sembra essere specifico per i singoli tumori. Ciò ha portato alla definizione di un fenotipo CpG-Island Methylator (CIMP) in CRC, un pannello di geni ipermetilati nei tumori CRC, e c'è un crescente corpo di letteratura sulla correlazione tra geni ipermetilati e CRC. Questa indagine si è concentrata principalmente sul DNA ottenuto da biopsie di CRC, ma negli ultimi anni l'attenzione si è spostata sul DNA ipermetilato ottenuto da campioni di sangue e feci.

I geni ipermetilati che sono stati analizzati nel sangue di pazienti con CRC sono ad es. SDC2, THBD, HIC1, RASSF1A. SEPT9 ipermetilato è stato analizzato in un ampio studio prospettico per valutare le sue prestazioni come marcatore di screening, ma questo ha rivelato solo una sensibilità del 48,2% con una specificità del 91,5%. Tuttavia, quando le regioni del promotore ipermetilato vengono analizzate insieme ad altre come parte di un pannello di biomarcatori, sono state riportate prestazioni nettamente migliori. Un pannello di biomarcatori composto da RASSF1A, APC, MGMT e Wif-1 ha raggiunto una sensibilità dell'86,5% e una specificità del 92,1% per il rilevamento di CRC.

Da questi studi è evidente che il profilo del DNA ipermetilato nei campioni di sangue dei pazienti con CRC è diverso dal profilo misurato nei controlli sani.

Sono stati condotti solo due studi, studiando in modo prospettico la relazione tra l'ipermetilazione del DNA misurata nel sangue dei pazienti con CRC e il rischio di recidiva del cancro. Questi studi sono limitati analizzando solo una singola regione del promotore genico (p16) e un basso numero di partecipanti allo studio.

Gli studi di cui sopra mostrano che il DNA ipermetilato può essere rilevato nel sangue dei pazienti con CRC, promuovendolo come biomarcatore per CRC. Nessuno studio ha tuttavia analizzato in modo prospettico le prestazioni in base al trattamento e alla recidiva della malattia nei pazienti con CRC.

Sono stati condotti studi sul DNA ipermetilato nelle feci di pazienti con CRC utilizzando marcatori di ipermetilazione di un singolo gene. Il gene principalmente analizzato è stato ipermetilato VIM che ha anche un kit disponibile in commercio per l'analisi delle feci. L'attenzione negli studi sulle feci è stata l'ipermetilazione del DNA come marcatore di screening per CRC. Uno studio ha combinato il test iFOBT con l'ipermetilazione del gene PHACTR3, estratto dal fluido iFOBT. Un risultato positivo in almeno uno dei due test ha aumentato la sensibilità al 95% (19/20) con un'elevata specificità del 94% (45/48) per CRC e adenomi avanzati.

La maggior parte dei metodi di analisi richiede la conversione del DNA con bisolfito per il rilevamento delle citosine metilate e Pedersen et al. (2012) hanno recentemente pubblicato un articolo che affronta questo passaggio chiave che richiede tempo, riducendo il tempo di analisi e aumentando il recupero di quantità sparse di DNA (<0,1 ng/ml), rendendo il test più clinicamente applicabile.

In sintesi, il DNA raccolto da campioni di sangue e feci di pazienti con CRC è stato analizzato allo scopo di scoprire geni ipermetilati specifici per CRC. L'ipermetilazione di questi geni specifici nei campioni di sangue è stata associata a prognosi infausta (p16, HLTF, TMEFF1, ALX4, VIM e FBN2), diagnosi precoce (APC, TAC1, SEPT9, NEUROG1, RASSF1A, SDC2 e THBD) e potenziale recidiva marcatori per i pazienti con CRC (p16 e TFPI2). Soprattutto THBD e SDC2 mostrano grandi promesse come marcatori di CRC in fase iniziale, e il fatto che sembri possibile utilizzare la metilazione del DNA nel sangue come marcatore di recidiva della malattia giustifica ulteriori ricerche, utilizzando questi geni singolarmente o insieme ad altri. L'ipermetilazione del DNA nei campioni di feci dei pazienti con CRC non è stata analizzata in modo approfondito come nei campioni di sangue, sebbene il rilevamento di frammenti di DNA ipermetilato nei campioni di feci possa essere utilizzato durante lo screening per CRC. SFRP2, TMEFF2, SPG20, TFPI2 e PHACTR3 hanno mostrato risultati promettenti nel rilevamento di CRC nelle fasi iniziali o nelle lesioni precancerose. Il fatto che PHACTR3 possa essere rilevato nel fluido iFOBT (raggiungendo una maggiore sensibilità e specificità) indica un possibile nuovo metodo di screening, in cui l'ipermetilazione del DNA viene analizzata in un campione di feci. Esistono tuttavia problemi riguardanti la sensibilità analitica del DNA ipermetilato nei campioni di feci di pazienti con CRC. La sensibilità diagnostica per i tumori del lato destro è inferiore rispetto ai tumori del lato sinistro, suggerendo la degradazione del DNA nel lume del colon prima dell'escrezione delle feci. Ciò promuove il sangue come mezzo di scelta per il rilevamento di geni ipermetilati come biomarcatori nella diagnosi, prognosi e rilevamento delle recidive di CRC.

METODO E PARTECIPANTI ALLO STUDIO

1. Per proporre le regioni promotrici del DNA ipermetilato più sensibili e specifiche per il rilevamento di CRC, sarà intrapresa una revisione della letteratura attualmente disponibile. I criteri di ricerca sono elencati nella sezione precedente.

2. Pazienti con cancro del colon-retto:

   Saranno utilizzati campioni di sangue di circa 210 pazienti con diagnosi di carcinoma del colon-retto prelevati prospetticamente e consecutivamente presso il Dipartimento di Gastroenterologia Chirurgica, Aalborg University Hospital durante il periodo di tempo 2003-2006. I campioni di sangue sono stati prelevati al momento della diagnosi, prima e dopo il trattamento (chirurgico e radio-chemioterapico) ea intervalli regolari per un periodo di tempo di due anni dopo il trattamento. Questi campioni di sangue sono stati raccolti durante un precedente studio di dottorato: "Tromboembolismo venoso pre e postoperatorio in pazienti con cancro del colon-retto - implicazioni della radioterapia" (numero ID VN 2003/102). In collaborazione con la Sezione di Diagnostica Molecolare, Biochimica Clinica, Ospedale Universitario di Aalborg, il profilo di metilazione delle regioni del promotore del DNA libero nel plasma sarà analizzato mediante PCR (reazione a catena della polimerasi) specifica per la metilazione basata su un metodo di trattamento con bisolfito accelerato.

3. Pazienti con malattie infiammatorie intestinali In collaborazione con il Dipartimento di Gastroenterologia Medica, Aalborg University Hospital, saranno reclutati circa 100 pazienti con colite ulcerosa per il prelievo di sangue (28 ml). In collaborazione con la Sezione di Diagnostica Molecolare, Biochimica Clinica, Ospedale Universitario di Aalborg, il profilo di metilazione delle regioni del promotore del DNA libero nel plasma sarà analizzato mediante PCR (reazione a catena della polimerasi) specifica per la metilazione basata su un metodo di trattamento con bisolfito accelerato.

4. Gruppo di controllo:

   Campioni di sangue (8ml) da pazienti (n=142) sottoposti a work-up per tumori maligni del tratto gastrointestinale inferiore durante il periodo 2003-2006. È stata eseguita la colonscopia e non sono state riscontrate lesioni maligne o precancerose. I campioni di sangue sono stati raccolti prima/dopo la colonscopia. Questi campioni di sangue sono stati raccolti durante un precedente studio di dottorato: "Tromboembolismo venoso pre e postoperatorio in pazienti con cancro del colon-retto - implicazioni della radioterapia" (numero ID VN 2003/102). I campioni di plasma saranno analizzati presso la Sezione di Diagnostica Molecolare, Biochimica Clinica, Aalborg University Hospital, e sarà analizzato il profilo di metilazione del DNA libero nel plasma, utilizzando la PCR specifica per la metilazione basata sul protocollo di trattamento con bisolfito accelerato.

5. Convalida esterna:

   Casi:

   I campioni di sangue di 143 pazienti sono stati raccolti in modo prospettico e consecutivo per uno studio precedente sull'effetto degli acidi grassi omega 3 e sulle complicanze postoperatorie dopo la chirurgia del colon-retto. Tutti i partecipanti allo studio hanno fornito il consenso informato scritto (N-VN-20050035).

   Controlli:

   Saranno reclutati circa 100 soggetti di controllo con sangue fecale occulto positivo ma con una colonscopia normale per il prelievo di sangue (28 ml). In collaborazione con la Sezione di Diagnostica Molecolare, Biochimica Clinica, Ospedale Universitario di Aalborg, il profilo di metilazione delle regioni del promotore del DNA libero nel plasma sarà analizzato mediante PCR (reazione a catena della polimerasi) specifica per la metilazione basata su un metodo di trattamento con bisolfito accelerato.

   Criterio di inclusione:

   Pazienti indirizzati al Dipartimento di Chirurgia Gastrointestinale, Aalborg University Hospital, con un test delle feci positivo per CRC ma senza segni di cancro alla successiva colonscopia.

6. Prelievo di sangue:

   I campioni di sangue saranno prelevati mediante prelievo venoso in conformità con le procedure dell'azione concertata europea sulla trombosi (ECAT).

7. PCR specifica per la metilazione:

   In collaborazione con la Sezione di Diagnostica Molecolare, Biochimica Clinica, Ospedale Universitario di Aalborg, il profilo di metilazione delle regioni del promotore del DNA acellulare sarà analizzato in campioni di plasma EDTA mediante PCR specifica per la metilazione basata sul protocollo del bisolfito accelerato.

8. Biobanca Qualsiasi materiale residuo (campioni di sangue) dallo studio sarà conservato per quindici anni e successivamente i campioni rimanenti saranno trasferiti alla biobanca nazionale danese.