Metilazione del DNA in bambini e adolescenti con diabete mellito di tipo 1 (METHYLDIAB) (METHYLDIAB)

Il diabete mellito di tipo 1 (T1DM) è una malattia autoimmune ben studiata che provoca carenza di insulina dovuta alla perdita selettiva di cellule beta. I fattori ambientali e genetici sembrano avere una complessa interazione in individui geneticamente predisposti che portano allo sviluppo del T1DM.

L'epigenetica è un nuovo campo della biologia che studia i cambiamenti ereditari nell'espressione dell'acido desossiribonucleico (DNA) che non possono essere attribuiti all'alterazione della sequenza del DNA tramite metilazione del DNA, modifica dell'istone e micro-RNA che agiscono come regolatori post-trascrizionali.

La metilazione della citosina - guanosina dinucleotidi (CpG), situata nella regione del promotore dei geni, svolge un ruolo vitale nella trascrizione e nell'espressione genica ed è catalizzata nella posizione 5' della citosina tramite enzimi chiamati DNA metiltransferasi (DNMT).

Finora è stato pubblicato un numero limitato di studi riguardanti l'epigenetica nei pazienti pediatrici con T1DM. Lo scopo del presente studio è quello di indagare il pattern di metilazione delle isole CpG nelle regioni del promotore di specifici geni di suscettibilità come la fosfatasi della tirosina proteica, il tipo non recettore 22 (PTPN-22), l'insulina (INS) e l'antigene leucocitario umano G (HLA -G), estratti da globuli bianchi (WBC) da T1DM e controlli sani bambini e adolescenti.

Sono stati reclutati venti pazienti e venti controlli abbinati per età e sesso. È stata ottenuta una dettagliata storia personale, familiare, gestazionale/perinatale ed è stato eseguito un esame fisico approfondito in tutti i partecipanti allo studio. Entrambi i gruppi ei loro parenti di primo grado non avevano precedenti di altre malattie autoimmuni.

I genitori hanno fornito il consenso informato scritto per la partecipazione dei propri figli, secondo la dichiarazione di Helsinki per la ricerca. che coinvolgono soggetti umani.

I protocolli sono stati approvati dal Comitato di Bioetica della Facoltà di Medicina, Facoltà di Scienze della Salute, Università Aristotele di Salonicco, Salonicco, Grecia (Protocollo n. 185/30.12.2015).

Campioni di sangue intero sono stati raccolti da entrambi i gruppi dopo un periodo di digiuno di 12 ore e conservati immediatamente a -80°C.

Il DNA è stato estratto dai campioni di sangue utilizzando il kit di estrazione del DNA QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN Inc, CA, USA), come suggerito dal produttore. I campioni isolati sono stati quantificati spettrofotometricamente utilizzando l'odds ratio (rapporto OD) 260/280 (1 OD = 50 μg/ml), (BioPhotometer 6131 Eppendorf AG, Germania). Il trattamento con bisolfito è stato condotto su 300 ng di DNA di ciascun campione utilizzando il kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research, Methylation-Gold, USA), come raccomandato dal produttore. Il trattamento con bisolfato di sodio converte le citosine non metilate in uracili, mentre le citosine metilate rimangono invariate nelle stesse condizioni stabili.

Per l'amplificazione del promotore del gene INS, i primer specifici del gene sono stati utilizzati come segue: INS-Forward 5'-TATTTTGGAATTTTGAGTTTATT-3' e INS-Reverse 5'-AACAAAAATCTAAAAACAACAA-3', per PTPN-22-Forward 5'-TTTTGGTTTATGTTGTAGAGT -3΄ e PTPN-22 Reverse 5΄- ATTTTATTTTATTATTTATATGTAA-3' e per HLA-SOL- Forward 5'-TAGGGAGTTTAGTTTAGGGAT -3' e Reverse 5'- TTAAGGATGGTGGTTATGG -3'.

Ulteriore sequenza dell'adattatore di sporgenza è stata aggiunta ai primer specifici del locus per le regioni da prendere di mira (Nextera Transposase Adaptors, Illumina), in ordine alla costruzione rapida delle librerie di Next Generation Sequencing (NGS). I prodotti Polymerase Chain Reaction (PCR) sono stati amplificati su uno strumento a rampa a bassa temperatura, il termociclatore 9700 (Eppendorf AG No5341, modalità di emulazione 9600) utilizzando AmpliTaq Gold DNA Polymerase.

Dopo la purificazione dei prodotti PCR con biglie super magnetiche altamente reattive NucleoMag NGS Clean-up e Size Select (Macherey-Nagel. Gatto. Numero 744970.5.), sono stati raggruppati in quantità molari simili e inviati per la costruzione della libreria secondo le istruzioni del produttore, Nextera XT DNA Library Preparation kit, Research Illumina.

Per NGS le letture paired-end sono state selezionate a una formazione di lunghezza di lettura di 2 x 250 paia di basi, su una piattaforma MiSeq di Illumina.

Le letture dell'analisi della sequenza sono state eseguite utilizzando file FASTQ e lo stato di metilazione è stato stimato con lo strumento ampliMethProfiler, una pipeline basata su Python per ampliconi sequenziati con bisolfito profondo mirati. Lo stato di metilazione è stato analizzato in dieci siti CpG del promotore del gene INS, quattro siti CpG di PTPN -22 gene e diciannove siti CpG del gene HLA-G attorno al sito di inizio trascrizionale (TSS).

Le sequenze e l'identificazione dei siti metilati e non metilati saranno interpretate da scienziati bioinformatici.

Verrà creato un Data-Base e tutti i dati saranno sottoposti ad analisi statistica. I risultati e le conclusioni del presente studio saranno pubblicati su riviste peer-review e presentati in Congressi Nazionali ed Internazionali.