Determinazione delle caratteristiche genomiche, trascrittomiche e funzionali delle cellule tumorali nelle emopatie iperinfiammatorie (GEN-HEMO-INF)

Le malattie autoinfiammatorie (AID) sono definite da disturbi dell'immunità innata. Si manifestano come episodi di infiammazione associati a segni generali e danni d'organo, principalmente all'apparato cutaneo, muscolo-scheletrico e digerente. La maggior parte degli AID monogenici descritti fino ad oggi inizia nell'infanzia. A parte la ridotta qualità della vita e i danni agli organi correlati alla malattia (ad es. sordità nelle sindromi periodiche associate alla criopirina), la complicanza più grave dell'AIDS è l'amiloidosi infiammatoria (AA), che può portare a insufficienza renale e dialisi. Più recentemente, sono stati descritti AID a esordio tardivo, secondari a mutazioni somatiche in geni autoinfiammatori, principalmente NLRP3 (1). Questa scoperta si inserisce in un contesto più generale di messa in evidenza di nuove forme di malattie genetiche ad esordio tardivo legate a mutazioni somatiche. Queste scoperte sono state rese possibili dalla rivoluzione delle tecniche di sequenziamento e in particolare dal sequenziamento di nuova generazione che consente un'analisi più approfondita rispetto alla tecnica di Sanger.

Le neoplasie ematiche, note come emopatie clonali, siano esse mieloidi (come la sindrome mielodisplastica) o linfoidi (come il mieloma multiplo), sono in costante aumento nella popolazione generale. Sono associati ad un accumulo di mutazioni genetiche somatiche che conferiscono proprietà di sopravvivenza e proliferazione alle cellule tumorali (2). Un certo numero di manifestazioni di queste emopatie clonali sono correlate all'attivazione di vie infiammatorie e in particolare all'attivazione di un inflammasoma. Ad esempio, è stato dimostrato che la piroptosi attraverso l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 potrebbe essere uno dei meccanismi fisiopatologici delle sindromi mielodisplastiche (3). Inoltre, è stato dimostrato che le citochine infiammatorie come IL1 e IL6 svolgono un ruolo come fattori di crescita in queste emopatie (4). Tuttavia, i meccanismi alla base dell'attivazione dell'inflammasoma e della produzione di tali citochine sono attualmente sconosciuti.

Un certo numero di pazienti con emopatie clonali sviluppa sintomi e complicanze simili a quelli riscontrati durante l'AIDS. In particolare, all'interno del centro di riferimento per le malattie autoinfiammatorie e l'amiloidosi nell'adulto, abbiamo individuato pazienti con sindromi mielodisplastiche o gammopatie clonali complicate da sintomi autoinfiammatori o amiloidosi da AA. Queste manifestazioni nel contesto delle emopatie clonali potrebbero essere chiamate "emopatie iperinfiammatorie".

La nostra ipotesi è che le manifestazioni infiammatorie che si verificano in questi pazienti siano secondarie al verificarsi di mutazioni somatiche in geni noti per essere coinvolti nell'immunità innata e nell'AID.

Il nostro obiettivo principale è quello di eseguire in pazienti con emopatia iperinfiammatoria uno studio funzionale alla ricerca dell'attivazione delle vie infiammatorie; quindi uno studio parallelo genomico e trascrittomico utilizzando una metodologia innovativa (5), al fine di indagare se esistono mutazioni somatiche dei geni dell'immunità innata in una sottopopolazione clonale e il loro impatto sull'espressione genica.

Il primo passo sarà identificare la firma infiammatoria delle cellule del sangue mononucleari dai pazienti. Per fare questo, recupereremo le cellule dal sangue e dal midollo osseo. Esperimenti quantitativi in ​​tempo reale ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) e PCR (Polymerase Chain Reaction) quantificheranno la produzione di citochine pro-infiammatorie. Inoltre, verranno eseguiti esperimenti di citometria a flusso con co-marcatura di membrana e intracellulare. Questi esperimenti, eseguiti di routine in laboratorio, permetteranno di identificare il tipo di cellula responsabile della sovrapproduzione di citochine che potrebbe spiegare i sintomi.

La seconda fase, veramente innovativa e con tecniche all'avanguardia, consisterà nell'effettuare l'analisi genomica e trascrittomica delle cellule tumorali. Per questo utilizzeremo metodi noti come "single cell analysis" con sequenziamento parallelo del genoma e del trascrittoma. Lo scopo dell'analisi genomica è la ricerca di mutazioni somatiche presenti nelle cellule tumorali e il loro confronto con quelle note per essere associate ad AID (confronto con il database europeo Infevers in particolare. I risultati genomici saranno anche confrontati con database internazionali di cellule tumorali per cercare mutazioni nelle cellule tumorali che potrebbero spiegare questa presentazione clinica. Questi studi sui Big Data sono necessari in considerazione dell'elevato numero di mutazioni attese nelle cellule tumorali. L'associazione con lo studio trascrittomico parallelo consentirà un'analisi di clustering non supervisionata per studiare l'effetto delle mutazioni somatiche sull'espressione genica. In effetti, è attualmente riconosciuto che le conseguenze di una mutazione genetica devono essere analizzate sia dal suo effetto sulla struttura proteica, ma anche dal suo effetto sull'epigenetica. Oggi questo tipo di analisi è possibile utilizzando il metodo di analisi dell'intelligenza artificiale.