Utilità diagnostica del DNA libero cellulare del Mycobacterium Tuberculosis (MTB cfDNA) nel versamento pleurico tubercolare e non tubercolare (MYDNITE-2)

La tubercolosi (TBC) rimane una delle principali malattie infettive a livello globale. Secondo il Global TB Report dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) nel 2023, la tubercolosi è la seconda causa di morte infettiva dopo il COVID-19 nel 2022. La tubercolosi extrapolmonare, tra cui la pleurite tubercolare (TBP) è uno dei sottotipi più comuni, pone ulteriori ostacoli al controllo globale della tubercolosi a causa della sua difficoltà di diagnosi. Esiste un'ampia variazione geografica nell'incidenza del TBP, con la percentuale di TBP tra tutti i pazienti affetti da TBC che varia dal 2,2% al 31,4%. Una crescente incidenza di TBP è stata notata in due ampi studi retrospettivi di coorte cinesi.

La natura paucibacillare del TBP porta alla sua sfida diagnostica. Nonostante sia un test diagnostico gold standard, la sensibilità diagnostica della coltura del Mycobacterium tuberculosis (MTB) nel liquido pleurico non è ottimale. Varia tra il 7,0% e il 75,0%, a seconda del terreno di coltura e dello stato dell'HIV. Anche i tempi di consegna lunghi, da 4 a 8 settimane, ne compromettono anche la praticità clinica. Le tecniche PCR commerciali, come Xpert MTB/RIF o Xpert Ultra, sono test rapidi e specifici con risultati positivi. Tuttavia, la loro utilità è limitata da una sensibilità non ottimale. La biopsia pleurica per istologia e la combinazione istologia/coltura potrebbero aumentare la sensibilità al 66% e al 79%, ma questa procedura è più invasiva della toracentesi. L'adenosina deaminasi del liquido pleurico (ADA) è il biomarcatore più comunemente studiato, con sensibilità e specificità diagnostica di 0,93 e 0,90 ad un cut-off di 40 U/L. Il suo range di cut-off può variare a seconda delle caratteristiche del paziente (età, comorbilità). La difficoltà nella diagnosi della TBP, pertanto, porta a ritardare l’inizio del trattamento anti-TBC. Il trattamento empirico anti-TBC può essere iniziato sulla base di presentazioni cliniche compatibili senza risultati microbiologici diagnostici confermativi, con il rischio di tossicità del trattamento (ad es. epatotossicità). Ciò suggerisce un’esigenza clinica insoddisfatta di uno strumento diagnostico migliore per il TBP.

Il rilevamento del DNA libero da cellule MTB (cfDNA) nel liquido pleurico può risolvere i problemi di cui sopra. È un potenziale strumento diagnostico con minima invasività e, soprattutto, una conferma diretta del MTB nello spazio pleurico. Tuttavia, i precedenti metodi basati sulla PCR riportavano una sensibilità non ottimale per la diagnosi di TBP, pari a circa il 40-80%. La sensibilità può essere limitata dal basso livello di MTB cfDNA e dal target a gene singolo (IS6110 o devR) nel rilevamento. Con il progresso della tecnologia di sequenziamento di nuova generazione (NGS), il rilevamento del cfDNA microbico mediante NGS metagenomico (mNGS) è stato applicato nella diagnostica delle malattie infettive. Chang et al. hanno precedentemente valutato l'uso di mNGS in campioni di sangue e urina per la diagnostica della tubercolosi. Hanno rivelato che tale metodologia è limitata dalla bassa concentrazione di MTB e dallo sfondo di DNA contaminante di micobatteri non tubercolari (NTM), che condivide sequenze simili al MTB patogeno.

Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un nuovo test di laboratorio che misura i livelli di cfDNA MTB. Ipotizziamo che il nuovo test MTB cfDNA abbia prestazioni diagnostiche migliori rispetto ai metodi microbiologici convenzionali nel discriminare i versamenti pleurici dovuti a TBP da quelli non-TBP. Poiché la coorte di sviluppo contiene solo un numero limitato di campioni di liquido pleurico, è necessario uno studio di conferma su larga scala contenente versamenti pleurici con un ampio spettro di cause per confermarne l'utilità clinica prima di essere introdotti nella pratica clinica. Questo studio ha tre obiettivi principali. In primo luogo, l’accuratezza diagnostica del nuovo test MTB cfDNA nella diagnosi del TBP sarà determinata utilizzando un’ampia coorte contenente campioni di liquido pleurico di varie cause provenienti da paesi con diversi tassi di tubercolosi. In secondo luogo, verranno identificati i fattori clinici e di laboratorio che determinano il livello di cfDNA dell'MTB nel liquido pleurico. In terzo luogo, verrà esplorata la capacità del test di catturare diversi geni di resistenza ai farmaci anti-TB sul liquido pleurico proveniente da aree endemiche della DR-TB.