体重、腸内微生物叢、GPR41およびGPR43の発現に対するPPI療法の影響

研究計画:

UCH内視鏡検査室でスクリーニングまたはサーベイランス結腸内視鏡検査（結腸直腸がん用）を受ける予定の胃腸症状のない患者は、包含基準および除外基準に基づいて研究のためにスクリーニングされる。 研究に同意した適格な患者は、身長、体重、人口統計情報が測定され記録されます。 彼らは体重/食事履歴のアンケートに記入します。 患者は、定期的な臨床ケアごとにスクリーニング/監視結腸内視鏡検査を受けます。 残留便は結腸鏡を通して標準的に吸引され、粘膜を完全に視覚化してポリープの検出を強化します。 S状結腸、盲腸、回腸末端の3か所から便を吸引します。 証拠は、（結腸内視鏡検査の前に）腸の準備をしても、大多数の被験者の腸内細菌叢の組成に大きな変化がないことを示唆しています。 これら 3 つの部位のそれぞれで、4 つの小さなピンチ生検も行います。 便吸引物および生検標本は液体窒素中で急速冷凍され、アッセイに必要になるまで-80℃で凍結されます。

合計 48 人の被験者を 4 つのグループ (OB/PPI、OB/非 PPI、NW/PPI、および NW/非 PPI) に均等に分割して登録します。 上記の包含/除外基準を満たす週あたり約 40 ～ 50 人の患者が UCH でスクリーニング/監視結腸内視鏡検査を受けており、目標登録を達成するには 6 ～ 9 か月にわたって週 2 ～ 3 人の患者を募集することが現実的です。

目的 1: 標準体重 (NW) および肥満 (OB) 患者の結腸および回腸末端の腸内細菌叢に対する PPI 使用の影響を調べること。 腸内マイクロバイオームは、16S rRNA シーケンスによってプロファイリングされ、腸の生物多様性における PPI 関連の変化が特定されます。

便吸引物と、S 状結腸、盲腸、および回腸終末からの粘膜生検には、別個の滅菌標本収集容器が使用されます。 マイクロバイオーム分析にはハイスループット DNA シークエンシングが使用されます。

マイクロバイオーム 16S rRNA プロファイリング 腸標本からコミュニティ全体のゲノム DNA を調製し、前述のように 16S rRNA 遺伝子を PCR 増幅します。 ペアエンド多重シーケンスが実行されます。 1 回の実行で 1,000 万～2,000 万の DNA シーケンスが生成され、サンプルごとに 100,000 の rRNA リードが生成され、>99% のシーケンス カバレッジが保証されます。 逆多重化、品質フィルタリング、キメラ除去および配列分類 (SINA/Silva を使用) は以前の出版物に続きます。 類似した配列は、分類に基づいて操作分類単位 (OTU) にグループ化されます。

マイクロバイオーム データ分析 主な結果は微生物グループの相対存在量 (PRA) パーセントであり、これは PPI 使用者と胃酸抑制薬の非使用者の間で異なるだろうと我々は仮説を立てています。 実験グループ間で異なる特定の微生物グループ (種/属/門) は、ノンパラメトリックな 2 部統計を使用して特定されます。40 統計分析は = 0.05 で評価され、誤発見率 (FDR) について p 値が補正されます。41 結果は種特異的 QPCR によって検証されます。

目的 2: PPI の使用により、NW および OB の個体の発酵サイクルに使用される腸内細菌 RNA の相対量が変化するかどうかを判断すること。 私たちは、腸内微生物叢から調製したバルク RNA のショットガン シーケンスを実行して、PPI を摂取している患者で差次的に発現している微生物の代謝経路を特定します。 回腸末端、盲腸、およびＳ状結腸から吸引された便は、上で詳述したように採取される。

ＲＮＡの単離および配列決定 微生物ＲＮＡは、ＲｉｂｏＰｕｒｅ細菌抽出キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国）を使用して、５０ｍｇの糞便吸引物から抽出される。 このパイロットでは、OB/PPI、OB/非 PPI、NW/PPI、および NW/非 PPI の 4 つのグループに均等に分割された合計 48 人の被験者からの検体をアッセイします。 宿主および微生物の rRNA は、Ribo-Zero 細菌および Ribo-Zero マウス キット (Epicentre, Inc, USA) を使用して除去されます。 RNA サンプルは、ScriptSeq v2 RNA-Seq (細菌) キット (Epicentre, Inc, USA) を使用して配列決定用に調製されます。 シーケンスは、深い範囲をカバーする Illumina HiSeq2000 プラットフォーム (UC-Denver Microarray および Genomics Core) で実行されます。 再現性の品質を保証するために、各検体の 2 つの mRNA サンプルがプールされ、配列が決定されます。 このパイロット実験では、微生物メタトランスクリプトーム データセットごとに、サンプルあたり約 20x106 のシングルエンド 150 塩基リードを生成します。

メタトランスクリプトーム データ分析 細菌転写物のアノテーションと列挙は、GenBank および NCBI の非重複タンパク質データベースで現在利用可能な約 1800 の細菌ゲノム配列に対する BLASTX 検索を使用して、E 値カットオフ <10- を使用してペプチド レベルで実行されます。 5.44 サンプル間の広範な機能の違いは、COG、KEGG48、および RAST/SEED ツールを通じて生成されたアノテーションを使用して評価されます。49、 腸内微生物トランスクリプトームの統計分析は、グループ間で差次的に発現する代謝経路の同定に焦点を当てます。 高品質のアノテーション (E<10-5) を持つ遺伝子を使用して、被験者 (N) ごとに遺伝子 (M) の NxM マトリックスを構築し、特定の遺伝子と被験者に対してアノテーションが付けられた配列リードの数を記録します。 被験者 (N) ごとの遺伝子カテゴリー (M) の同様の NxM マトリックスを構築して、機能カテゴリーに割り当てられた配列リードの分布を表にします。 治療群間で有病率または存在量が異なる遺伝子または遺伝子カテゴリーは、マトリックス内の各遺伝子/カテゴリーに適用されるフィッシャー直接確率検定またはクラスカル・ウォリス検定によってそれぞれ特定されます。 FDR の補正後、有意性は = 0.05 で評価されます。41 P 値を使用して、患者コホート全体にわたる遺伝子発現をスクリーニングするために QPCR を使用したフォローアップ検証のための候補遺伝子リストの優先順位付けが行われます。

目的 3: NW および OB 患者の結腸および回腸末端における GPR41、GPR43、およびそれらのエフェクター遺伝子の発現が PPI の使用によってどの程度変化するかを決定すること。 生検標本は、微生物の SCFA 産生によって影響を受ける標的遺伝子の発現をモニタリングするために、RT-QPCR アッセイのパネルに供されます。 回腸末端、盲腸、およびS状結腸からの生検は、上で詳述したように取得される。

定量的逆転写酵素 PCR (qRT-PCR) 分析 RNeasy Mini Kit (Qiagen) および ISOGEN (WAKO) を使用して全 RNA を抽出します。 相補的 DNA は、RNA を鋳型として使用し、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素 (Invitrogen) で転写されます。 cDNA は、適切なプライマーを使用して Taq DNA ポリメラーゼ (TaKaRa) を用いた PCR によって増幅されます。 qRT-PCR分析は、DNA Engine Opticon-2 (MJ Research)を使用して実行されます。 式は重複して定量化されます。

サンプルサイズと検出力分析:

24 人の NW 参加者と 24 人の肥満 (OB) 参加者を登録します。 NW グループと OB グループの半数は PPI ユーザーであり、残りの半数は胃酸抑制薬の非ユーザーとなります。 目的 1 の主な結果は、ファーミクテスとバクテロイデスの PRA の違いです。 二元配置分散分析 (BMI カテゴリと PPI 使用の係数) が使用されます。 予備データに基づくと、ファーミクテスの PRA の違いを検出する検出力は 94% (72% 対 52%、SD は 20%)、バクテロイデテスの PRA の違いを検出する検出力は 95% (16% 対 5) になります。 % (SD は 5%))、PPI ユーザーと非ユーザーの間で変化します。 目的 2 の主な結果は発酵サイクルに特化した細菌 RNA の違いであり、目的 3 の結果は GPR 41 と GPR 43 の発現の違いです。 腸内微生物叢プロファイルとその後の SCFA 産生における予想される差異に基づいて、両方の結果について PPI ユーザーと非ユーザーの間で 25% の差が予想され、目標 2 と 3 の両方について 99% の検出力が得られます)。 NW グループと OB グループ内のサブグループ分析も実行します。