便秘炎症性および微生物転座マーカーの関連

研究デザインと母集団

患者と方法 2.1。 患者の選択 200 人の血液透析患者が募集されます。 機能性便秘はRome IV基準に従って診断されます。 内視鏡検査（S状結腸鏡検査、結腸内視鏡検査、胃十二指腸鏡検査）、放射線および超音波検査の評価により、すべての患者で腹腔および骨盤底の器質的病変が除外されます。

この調査は、2008 年に改訂されたヘルシンキ宣言に従って実施されます。 すべての患者は、研究に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提供します。 Tungs Taichung Metroharbour Hospital の腎部門のすべての患者は、前向きかつ連続的に含まれていました。 包含基準は、

1. 3ヶ月以上の血液透析
2. 20歳以上

除外基準は、慢性炎症性疾患の病歴、現在の感染症の存在、コラーゲン血管疾患、または免疫調節または免疫抑制治療です。

炎症性サイトカイン、エトタキシン-1、アミロイドAの測定

MCP-1、IL-6、CRP、IL-17A、およびカルプロテクチンの血漿レベルは、メーカーの指示に従って、市販のヒト ELISA キットでそれぞれテストされます。 ヒト血清エオタキシン 1 レベルは、メーカーのプロトコルに従って、市販の ELISA キット (R&D システム、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) を使用して決定されます。 血清中の血清アミロイド A 濃度を測定するために、市販の ELISA 手順が使用されます。

エンドトキシンおよびエンドトキシン Ig M、ならびに IgG コア抗体

血清中のエンドトキシンは、Lonza の Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 (カタログ番号 50-647U) (EU/ml) によって測定されます。 血清または血漿サンプルは、LAL 試薬水で 1:5 の比率で希釈されます。 エンドトキシンＩｇＧコア抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ（カタログ＃ＨＫ５０４）からのＥＬＩＳＡキットを使用して血漿中で測定される。 単位は、メーカーによる 1000 人の健康な成人の範囲の中央値に基づく IgG 標準中央値単位である GMU/ml として表されます。

CD14 および CD16 単核表現型の決定

抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて静脈穿刺により末梢血を採取する。 サイトメトリー分析の場合、CD14 (フルオレセイン イソチオシアネート (FITC) 結合; クローン RMO52; ベックマン コールター、フロリダ州マイアミ)、CD16 (フィコエリトリン (PE) 結合; クローン 3G8; ベックマン コールター、フロリダ州マイアミ)、 CD45 (フィコエリトリン シアニン-5 (PC5); クローン J33; ベックマン コールター、フロリダ州マイアミ)、および CD56 (クローン IM2073; ベックマン コールター、フロリダ州マイアミ) が使用されます。 簡単に言えば、100 μl の全血を、飽和量の上記のモノクローナル抗体および対応するアイソタイプ コントロールで染色します。 メーカーの推奨に従って室温で 15 分間インキュベートした後、OptiLyse C (Beckman Coulter、フロリダ州マイアミ) を加えて RBC を溶解し、サンプルを固定します。 固定された細胞は、6 時間以内にフローサイトメトリーで分析されます。

白血球および単球サブセット分布の決定は、FC500-Cytometer (Beckman Coulter) を使用して実行され、CXP 分析ソフトウェア (バージョン 2.2) が使用されます (Schroers et al., 2005)。 単球は、特定の前方および側方散乱プロファイルを示す CD45 陽性および CD56 陰性細胞として識別されます。 次に、単球を SSC/CD ドット プロットでゲートし、単球を単球散乱特性を持つ CD86 細胞として識別します。 CD16 を含む CD14 単球と CD16 を含まない CD14 単球のサブセットは、リポ多糖受容体 CD14 および CD16 (Fcgamma receptor III) の表面発現パターンに従って定義されます。 各サンプルから 100 万個の細胞を分析し、CD16 陽性単核細胞 (CD14+/CD16+ および CD14++/CD16+) の割合と全単球からの細胞数を蛍光マイクロビーズ (Flow-Count、Beckman Coulter) を使用して比較します。 CD86 抗体 (クローン HA5.2B7; Beckman Coulter、フロリダ州マイアミ) がこの研究で使用されています。

sCD14、LBP、ゾヌリン、I-FABP アッセイ

LBP および sCD14 マーカーを使用して微生物の移動を監視し、ゾヌリンおよび I-FABP を測定して腸の透過性を調べます。メーカーの推奨に従って、遊離ヒト LBP ELISA キットの定量化のための酵素免疫測定法を使用して、LBP 血漿レベルを測定します。 希釈倍率は1:800です。 sCD14 の血漿レベルは、メーカーの仕様書に従って、ヒト sCD14 キットを使用して測定されます。 希釈倍率は 1:200 です。 ゾヌリン血清レベルは、ヒトゾヌリンELISAキットを使用して測定されます。 I-FABP 血漿レベルは、メーカーの推奨に従って ELISA キットで測定されます。