構造染色体の再構成と脳障害

プロジェクトの説明 目的 1) 構造ゲノム変異の形成の分子機構は何ですか?

私たちはすでに 500 人を超える個別の SV からの WGS データを持っています。 根底にある突然変異と疾患のメカニズムを理解するために、構造的変異の検出と再配列のための位置情報を組み合わせます。 これは、重複（重複したゲノムセグメントの位置が正しい臨床的解釈の鍵となります）や複雑な再構成の場合に特に重要です。 次に、正確なブレークポイントが確立され、ブレークポイント ジャンクションが配列モチーフについて分析されます。

目的 2) 疾患の病理に関与する分子機構は何ですか?

まず、WGS を使用して構造バリアントを特定し、特徴付けます。 次に、SV の影響を受ける候補疾患遺伝子がどのように臨床症状を引き起こすかを理解するために、疾患の病理に関与する細胞機構を 3 つの方法で研究します。

パート1。 初代細胞のインビトロ研究: 発現とスプライシングへの影響は、RT-PCR、qPCR、およびウェスタンブロットを使用して患者細胞 (線維芽細胞または B 細胞株) で評価されます。

パート 2. 患者由来モデルでの in vitro 研究: 選択されたケースでは、人工多能性幹細胞と神経前駆細胞 (NES 細胞) を生成します。これは、患者由来の細胞における初期神経新生の影響を直接研究する機会を提供します。患者の細胞と正常対照由来の細胞を比較します。 私たちは、NES 細胞を使用した 2D 培養における初期神経新生の研究と、iPS 細胞株から直接 3D 培養で別の発生関連モデルである脳オルガノイド (ミニ脳) を生成することの両方に興味を持っています。 オルガノイド 3D 培養は、さまざまな脳領域の発達を再現するため、脳障害を調査するためのユニークなツールです。 さらに、3D 神経培養は細胞の成熟度を改善し、疾患の表現型の発現を刺激することで、疾患のメカニズムの理解を促進する可能性があります。

パート 3. ゼブラフィッシュ モデルにおける in vivo 研究: ゼブラフィッシュ (Danio rerio) は、正常および異常な発生学的発達の研究によく機能する in vivo システムです。 重複は、CRISPR/Cas9 誘発遺伝子破壊またはモルフォリノ ノックダウンによる RNA 過剰発現および欠失によってシミュレートされます。 表現型の評価は、患者で観察される表現型（頭の大きさ、頭蓋顔面欠陥、心血管奇形、繊毛欠陥など）に従って設計されます。

目的 3) 構造的ゲノム変異は遺伝子発現にどのような影響を与えるか?

私たちは 3 つの方法で長距離効果を研究する予定です。 パート1。 TAD 中断の臨床的影響を評価するために、臨床遺伝学アレイ データベース (希少な NDD を持つ 6,200 人以上の小児からのデータ)、LocusDB SV (WGS によって分析された希少疾患を持つ 1,000 人を超える患者からの SV コール) の CNV データでそのようなイベントを検索します。 Clinical Genomics SciLifeLab) および公的に利用可能なデータベース (DECIPHER、ICCG、および SWEGEN)。 バイオインフォマティクス解析では、SV を取り巻く既知の疾患遺伝子と患者の特徴の間の表現型の重複に関する情報と、組織特異的エンハンサーおよび TAD 領域との物理的な重複に関する情報を組み合わせます。 同様のメカニズムによって破壊された遺伝子を発見するために、新しい計算アプローチが設計されるでしょう。 追跡調査には、さらなる患者の特性評価とカスタマイズされた RNA 研究が含まれます。

パート 2. 患者サンプルのトランスクリプトーム解析は RNA-seq によって行われます。 すべての細胞ですべての遺伝子が転写的に活性であるわけではないため、この目的を成功裏に達成するための鍵は、生物学的に関連したサンプルにアクセスすることです。 生検が利用できない場合も多いため、そのような場合には、iPS 細胞が RNA 発現に対する生物学的に関連する影響を研究するための代替方法となります。 WGS と RNA-seq データのペアを使用する場合、隣接する遺伝子に対する SV の影響の読み取り値として、転写レベルと ASE の変化を統合します。

パート 3. 細胞および動物の研究: ヒト細胞株への CRISPR/Cas9 を含む特定の SV の導入は、初代細胞が利用できない場合に行われ、目標 2 の下で作成されたゼブラフィッシュ株は、生物レベルでの SV の全体的な影響を評価するために使用することもできます。 。