分子的手段による創傷感染の主要病原体の迅速な同定

背景: 創傷感染は通常、嫌気性菌と非嫌気性菌の両方が存在し、通常は好気性菌よりも嫌気性菌のほうが多く存在します (たとえば、穿孔性虫垂炎または壊疽性虫垂炎では、平均して 9 つの嫌気性菌と 3 つの好気性菌が見つかりました)。 多くの臨床検査室は、不適切な表現型特性と不正確な分類に基づく市販のキットを使用して、限られた嫌気性細菌学を行っています。 その結果、医師や外科医は創傷感染を経験的に治療する必要があり、抗菌剤に対する耐性の増加につながる最も耐性の嫌気性菌に対して活性な薬剤を使用する傾向があります。 現在利用可能な分子技術により、好気性および嫌気性の両方の微生物の正確かつ迅速な特性評価が可能になります。

目的/仮説: 分子生物学の手法を使用すると、創傷感染の原因となる微生物をより迅速かつ正確に特定できます。 表現型検査による培養および識別の現在の従来の方法は、時間がかかり、不正確です。

具体的な目的: 1) 重要な創傷病原体について、定量化を含む迅速な同定方法を開発する。2) 分子的手段および従来の培養によって創傷感染の細菌叢を分析する。組織生検と膿の両方が、両方の方法論によって研究されます。

研究デザイン: 私たちは、UCLA と提携しているオリーブビュー郡病院の一般外科サービスと VA メディカルセンターウェストロサンゼルスから、静脈内薬物乱用者の 50 の術後および外傷性創傷感染症と 50 の閉鎖性軟部組織膿瘍を毎年研究します。ロバート・ベニオン博士。 可能な限り、創傷からの膿とともに、処理のために創傷の活性端から組織生検を取得します。

我々は、我々のグループと他のグループによる以前の研究から得られた創傷感染のフローラに関する情報に基づいて、異なるタイプの創傷感染で遭遇する生物の種特異的なプライマー/プローブを開発し、これまでにない培養分離株から作られたプライマー/プローブで補った。遭遇した。 プライマーとプローブは、微生物の迅速な同定と定量を可能にするハイスループット手順 (リアルタイム PCR) で使用されます。 DNA 抽出とリアルタイム PCR の両方を含む全手順は、1 つのサンプルに対して 5 時間以内に完了できます。 複数のサンプルを同時に実行できます。 経験的に治療を開始する必要があるかもしれませんが、5 時間以内に細菌学的データが得られれば、より適切な抗菌薬に変更することができます。 同時に、別の分子アプローチである 16S rRNA 遺伝子クローニングを利用して、サンプルの全フローラを分析します。 まず、サンプルから抽出した DNA の PCR により、ユニバーサル (すべての細菌) プライマーを使用して 16S rRNA 遺伝子を増幅します。 次に、大腸菌でクローン ライブラリを構築し、すべてのクローンを 1500 塩基対までの 16S rDNA シーケンシングによって調べます。 これにより、「培養不能」と呼ばれる生物だけでなく、正常に培養できる生物も検出できます。 頻繁に遭遇する「栽培不可能な」生物は重要である可能性があります。したがって、それらを迅速に同定するためのプライマーとプローブを開発し、さまざまな手法を使用してこれらを培養しようとします (すでにいくつかのケースで成功しています)。 分子的アプローチが行われていると同時に、従来の文化的処理を使用します。 文化的アプローチは、追加の研究 (特に抗菌薬感受性試験) のための生物を提供し、新しい分子的アプローチと比較するための現在の基準として機能します。 培養は半定量的に行われ、同定は示されているように表現型試験によって補足された 16S rDNA 配列決定によって行われます。 文化的アプローチでは、通常、純粋培養で生物を分離するのに数日かかります。

2 つの分子的アプローチは、検出された生物に関して従来の文化的アプローチと比較されます。各標本は、比較のためにすべての手法で調査されます。

関連性：上記のさまざまな識別スキームの速度は、過去に可能であったよりもはるかに早く、正確で定量的な識別（従来の文化的アプローチよりも正確）を提供できることを明確に示しています. これにより、最も適切な治療法をより早期に適用し、最も強力な薬剤の経験的な使用を最小限に抑えることができます。 これにより、臨床転帰が改善され、抗菌薬耐性の可能性が減少し、コストも削減される可能性があります。 それは、さまざまな外科的創傷の感染菌叢とこれらの生物の抗菌薬感受性パターンのはるかに正確な図を提供します. 熱傷感染の場合と同様に、組織生検の定量的研究が、従来の創傷培養よりも真の感染菌叢のより良い画像を提供するかどうかを学びます. 「培養不可能な」細菌（腸と上気道の常在菌叢の最大の割合を実際に構成している）が臨床的に重要かどうかを学びます. 最後に、分子アプローチを改善するためのより完全なプライマー/プローブのセットを開発します。