분자적 수단에 의한 상처 감염의 주요 병원체의 신속한 식별

배경: 상처 감염은 일반적으로 혐기성 및 비혐기성 박테리아가 모두 존재하며 일반적으로 호기성 세균보다 혐기성 세균이 더 많습니다(예를 들어, 천공성 또는 괴저성 맹장염에서 평균 9개의 혐기성 세균과 3개의 호기성 세균을 발견했습니다). 많은 임상 실험실에서는 부적절한 표현형 특성과 부정확한 분류법을 기반으로 하는 상업용 키트를 사용하여 제한된 혐기성 세균학을 수행합니다. 결과적으로 내과의와 외과의는 상처 감염을 경험적으로 치료해야 하며 항균제에 대한 내성을 증가시키는 가장 저항력이 강한 혐기성 세균에 대해 활성이 있는 약물을 사용하는 경향이 있습니다. 현재 이용 가능한 분자 기술은 호기성 및 혐기성 미생물의 정확하고 신속한 특성 분석을 가능하게 합니다.

목적/가설: 분자생물학 기술을 사용하면 상처 감염의 원인이 되는 미생물을 보다 빠르고 정확하게 식별할 수 있습니다. 표현형 테스트에 의한 현재의 기존의 배양 및 식별 방법은 느리고 부정확합니다.

특정 목표: 1) 중요한 상처 병원체에 대한 정량화를 포함하는 신속한 식별 방법을 개발합니다. 2) 분자 수단 및 기존 배양을 통해 상처 감염의 세균총을 분석합니다. 조직 생검과 고름은 두 가지 방법론으로 모두 연구됩니다. 3) 소위 "경작 불가능한" 식물군의 발생률과 중요성을 결정합니다.

연구 설계: 우리는 매년 UCLA와 제휴한 Olive View County 병원의 일반 외과 서비스와 웨스트 로스앤젤레스 VA 의료 센터에서 정맥 약물 남용자의 수술 후 및 외상성 상처 감염 50개와 폐쇄 연조직 농양 50개를 연구할 것입니다. 로버트 베니온 박사. 가능할 때마다 우리는 상처의 고름과 함께 처리를 위해 상처의 활성 가장자리에서 조직 생검을 얻을 것입니다.

우리는 우리 그룹과 다른 사람들이 이전 연구에서 얻은 상처 감염의 식물상에 대한 정보를 기반으로 다른 유형의 상처 감염에서 접하는 유기체에 대한 종별 프라이머/프로브를 개발하고 이전에 없는 문화 분리주로 만든 프라이머/프로브를 보완할 것입니다. 만났다. 프라이머 및 프로브는 유기체의 신속한 식별 및 정량화를 허용하는 고처리량 절차(실시간 PCR)에 사용됩니다. DNA 추출과 real-time PCR을 포함한 전체 과정은 하나의 샘플에 대해 5시간 이내에 완료될 수 있습니다. 여러 샘플을 동시에 수행할 수 있습니다. 경험적으로 치료를 시작하는 것이 필요할 수 있지만, 5시간 후에 세균학적 데이터를 사용할 수 있게 되면 보다 적절한 항균제로 변경할 수 있습니다. 동시에 샘플의 총 식물상을 분석하기 위해 또 다른 분자적 접근 방식인 16S rRNA 유전자 클로닝을 활용할 것입니다. 먼저 샘플에서 추출한 DNA의 PCR을 통해 범용(모든 박테리아) 프라이머를 사용하여 16S rRNA 유전자를 증폭합니다. 그런 다음 대장균에서 클론 라이브러리를 구성하고 모든 클론을 ~1500 염기쌍의 16S rDNA 시퀀싱으로 연구합니다. 이를 통해 성공적으로 배양할 수 있는 유기체뿐만 아니라 "경작 불가능"이라고 하는 유기체를 감지할 수 있습니다. 자주 접하는 "재배 불가능한" 유기체는 중요할 수 있습니다. 따라서 우리는 신속한 식별을 위해 프라이머와 프로브를 개발하고 이를 배양하기 위해 다양한 기술을 사용할 것입니다(우리는 이미 몇 가지 사례에서 성공적으로 수행했습니다). 분자적 접근이 이루어짐과 동시에 우리는 기존의 문화 처리를 사용할 것입니다. 문화적 접근법은 추가 연구(특히 항균제 감수성 테스트)를 위한 유기체를 제공할 것이며 새로운 분자 접근법과 비교하기 위한 현재 표준 역할을 할 것입니다. 배양은 반정량적으로 수행되며 식별은 표시된 대로 표현형 테스트로 보완된 16S rDNA 시퀀싱에 의해 수행됩니다. 문화적인 접근 방식은 일반적으로 순수 문화에서 유기체를 분리하는 데 며칠이 걸립니다.

두 가지 분자적 접근 방식은 검출된 유기체 측면에서 기존의 문화적 접근 방식과 비교됩니다. 각 표본은 비교 목적으로 모든 기술로 연구됩니다.

관련성: 위에 표시된 다양한 식별 체계의 속도는 우리가 과거에 가능했던 것보다 훨씬 더 빨리 정확하고 정량적인 식별(기존의 문화적 접근 방식보다 더 정확함)을 제공할 수 있음을 분명히 보여줍니다. 이를 통해 가장 적절한 치료법을 훨씬 더 일찍 적용하고 가장 강력한 약제의 경험적 사용을 최소화해야 합니다. 이로 인해 임상 결과가 개선되고 항생제 내성 가능성이 줄어들며 비용도 절감될 수 있습니다. 그것은 다양한 수술 상처의 감염 세균총과 이러한 유기체의 항균 감수성 패턴에 대한 훨씬 더 정확한 그림을 제공할 것입니다. 우리는 화상 상처 감염에서와 같이 조직 생검에 대한 정량적 연구가 기존의 상처 배양보다 진정한 감염 세균총에 대한 더 나은 그림을 제공하는지 여부를 알아볼 것입니다. 우리는 "배양할 수 없는" 박테리아(실제로 장과 상부 호흡기관의 토착 세균총의 가장 큰 비율을 구성함)가 임상적으로 중요한지 여부를 알아볼 것입니다. 마지막으로 분자적 접근 방식을 개선하기 위해 보다 완전한 프라이머/프로브 세트를 개발할 것입니다.