A sebfertőzések legfontosabb kórokozóinak gyors azonosítása molekuláris eszközökkel

Háttér: A sebfertőzések jellemzően vegyesek, anaerob és nem anaerob baktériumok egyaránt jelen vannak, és általában több az anaerob, mint az aerob (például perforált vagy gangrénás vakbélgyulladás esetén átlagosan 9 anaerob és 3 aerob fertőzést találtunk). Számos klinikai laboratórium korlátozott anaerob bakteriológiát végez, kereskedelmi készleteket használva, amelyek nem megfelelő fenotípusos jellemzők és pontatlan taxonómia alapján. Ennek eredményeként az orvosoknak és a sebészeknek empirikusan kell kezelniük a sebfertőzéseket, és hajlamosak a legrezisztensebb anaerobok elleni hatóanyagok alkalmazására, ami az antimikrobiális szerekkel szembeni rezisztencia növekedéséhez vezet. A jelenleg rendelkezésre álló molekuláris technikák lehetővé teszik a mikroorganizmusok pontos és gyors jellemzését, mind aerob, mind anaerob módon.

Cél/hipotézis: A molekuláris biológiai technikák alkalmazása gyorsabban és pontosabban biztosítja a sebfertőzésért felelős mikroorganizmusok azonosítását. A fenotípusos teszteléssel történő tenyésztés és azonosítás jelenlegi hagyományos módszere lassú és pontatlan.

Konkrét célok: 1) Gyors azonosítási módszer kidolgozása, amely magában foglalja a fontos sebkórokozók mennyiségi meghatározását is, 2) A sebfertőzés bakteriális flórájának elemzése molekuláris módszerekkel és hagyományos tenyésztéssel; mind a szövetbiopsziát, mind a gennyet mindkét módszerrel vizsgáljuk. 3) Határozza meg az úgynevezett „művelhetetlen” flóra előfordulását és jelentőségét.

Tanulmánytervezés: Évente 50 posztoperatív és traumás sebfertőzést és 50 zárt lágyszöveti tályogot fogunk tanulmányozni intravénás kábítószer-fogyasztóknál az Olive View megyei kórház általános sebészeti szolgálatában, amely kapcsolatban áll az UCLA-val és a VA Medical Center West Los Angeles-ivel, együttműködve Dr. Robert Bennion. Lehetőség szerint a seb aktív széléről szövetbiopsziát veszünk feldolgozásra, a seb gennyével együtt.

Fajspecifikus primereket/próbákat fogunk kifejleszteni a különböző típusú sebfertőzésekben előforduló organizmusok számára a sebfertőzés flórájával kapcsolatos információk alapján, amelyeket a csoportunk és mások által végzett korábbi tanulmányokból nyertünk, és kiegészítünk olyan primerekkel/próbákkal, amelyeket korábban nem tenyésztett izolátumokból készítettek. találkozott. A primereket és próbákat nagy áteresztőképességű eljárásban (valós idejű PCR) fogják használni, amely lehetővé teszi az organizmusok gyors azonosítását és mennyiségi meghatározását. A teljes eljárás, beleértve a DNS-kivonást és a valós idejű PCR-t is, egy minta esetében 5 órán belül elvégezhető. Egyidejűleg több minta is készíthető. Bár szükség lehet a terápia empirikus megkezdésére, lehetőség nyílik a megfelelőbb antimikrobiális szerekre való áttérésre, ha a bakteriológiai adatok 5 órán belül rendelkezésre állnak. Ezzel párhuzamosan egy másik molekuláris megközelítést, a 16S rRNS gén klónozását alkalmazzuk a minta teljes flórájának elemzésére. Először a 16S rRNS géneket amplifikáljuk univerzális (minden baktérium) primerek segítségével a mintából kinyert DNS PCR segítségével. Ezután egy klónkönyvtárat hozunk létre E. coliban, és minden klónt körülbelül 1500 bázispárból álló 16S rDNS szekvenálással tanulmányozunk. Ez lehetővé teszi a „tenyészthetetlennek” nevezett, valamint a sikeresen tenyészthető szervezetek kimutatását. Bármilyen „tenyészthetetlen” szervezet, amellyel gyakran találkozunk, fontos lehet; ezért gyors azonosításukra primereket és próbákat fogunk fejleszteni, és sokféle technikát alkalmazunk ezek tenyésztésére (ezt néhány esetben már sikeresen meg is tettük). A molekuláris megközelítésekkel egy időben a hagyományos kulturális feldolgozást fogjuk alkalmazni. A kulturális megközelítés további vizsgálatokhoz (különösen az antimikrobiális érzékenység vizsgálatához) biztosít szervezeteket, és az új molekuláris megközelítésekkel való összehasonlítás jelenlegi standardjaként szolgál majd. A tenyésztést szemikvantitatív módon végezzük, és az azonosítást 16S rDNS szekvenálással, amelyet fenotípusos teszteléssel egészítünk ki, a jelzett módon. A kulturális megközelítés általában több napot vesz igénybe, amíg a szervezeteket tiszta tenyészetben izolálják.

A két molekuláris megközelítést összehasonlítjuk a hagyományos kulturális megközelítéssel a kimutatott organizmusok tekintetében; összehasonlítás céljából minden mintát minden technikával megvizsgálnak.

Relevancia: A fentebb jelzett különböző azonosítási sémák gyorsasága egyértelműen azt mutatja, hogy sokkal hamarabb tudnánk pontos, kvantitatív azonosítást (pontosabbat, mint a hagyományos kulturális megközelítés) biztosítani, mint a múltban. Ez a legmegfelelőbb terápia sokkal korábbi alkalmazásához vezet, és minimálisra csökkenti a legerősebb szereink empirikus felhasználását. Ez valószínűleg jobb klinikai eredményt, kisebb esélyt az antimikrobiális rezisztenciára és költségmegtakarítást is eredményez. Sokkal pontosabb képet ad majd a különféle műtéti sebek fertőző flórájáról és ezen organizmusok antimikrobiális érzékenységi mintázatáról. Megtudjuk, hogy az égési sebfertőzésekhez hasonlóan a szöveti biopsziák kvantitatív vizsgálata jobb képet ad-e a valódi fertőző flóráról, mint a hagyományos sebtenyészetek. Megtudjuk, hogy a „tenyészthetetlen” baktériumok (amelyek valójában a bél és a felső légutak őshonos flórájának legnagyobb százalékát teszik ki) klinikailag fontosak-e vagy sem. Végül kidolgozunk egy teljesebb primereket/próbákat a molekuláris megközelítés javítása érdekében.