Rychlá identifikace klíčových patogenů při infekci ran molekulárními prostředky

Východiska: Infekce ran jsou typicky smíšené, jsou přítomny anaerobní i neanaerobní bakterie a obvykle je více anaerobů než aerobů (např. u perforované nebo gangrenózní apendicitidy jsme našli v průměru 9 anaerobů a 3 aerobní). Mnoho klinických laboratoří provádí omezenou anaerobní bakteriologii pomocí komerčních souprav založených na neadekvátních fenotypových charakteristikách a nepřesné taxonomii. V důsledku toho musí lékaři a chirurgové léčit infekce ran empiricky a mají tendenci používat léky účinné proti nejodolnějším anaerobům, což vede ke zvýšené rezistenci vůči antimikrobiálním látkám. Nyní dostupné molekulární techniky umožňují přesnou a rychlou charakterizaci mikroorganismů, aerobních i anaerobních.

Cíl/Hypotéza: Použití technik molekulární biologie umožní rychlejší a přesnější identifikaci mikroorganismů odpovědných za infekci rány. Současná konvenční metoda kultivace a identifikace fenotypovým testováním je pomalá a nepřesná.

Specifické cíle: 1) vyvinout metodu rychlé identifikace, včetně kvantifikace, pro důležité patogeny v ráně, 2) analyzovat bakteriální flóru ranné infekce molekulárními prostředky a konvenční kultivací; obě tkáňové biopsie i hnis budou studovány oběma metodikami, 3) Zjistit výskyt a význam tzv. „nekultivovatelné“ flóry.

Design studie: Budeme ročně studovat 50 pooperačních a traumatických infekcí ran a 50 uzavřených abscesů měkkých tkání u osob užívajících nitrožilní drogy, z všeobecné chirurgické služby v Olive View County Hospital, přidružené k UCLA a VA Medical Center West Los Angeles, ve spolupráci s Dr. Robert Bennion. Kdykoli je to možné, získáme ke zpracování tkáňové biopsie z aktivního okraje rány spolu s hnisem z rány.

Vyvineme druhově specifické primery/sondy pro organismy, se kterými se setkáváme u různých typů infekcí ran, na základě informací o flóře infekce ran získaných z předchozích studií naší skupiny a dalších a doplněných primery/sondami vyrobenými z kulturních izolátů, které dříve nebyly setkali. Primery a sondy budou použity ve vysoce výkonném postupu (PCR v reálném čase), který umožňuje rychlou identifikaci a kvantifikaci organismů. Celý postup, včetně extrakce DNA a PCR v reálném čase, může být dokončen do 5 hodin pro jeden vzorek. Lze provést více vzorků současně. I když může být nutné zahájit terapii empiricky, bude možné přejít na vhodnější antimikrobiální látky, jakmile budou bakteriologická data k dispozici za 5 hodin. Současně použijeme další molekulární přístup, klonování genu 16S rRNA, k analýze celkové flóry vzorku. Nejprve amplifikujeme 16S rRNA geny pomocí univerzálních (všech bakterií) primerů pomocí PCR DNA extrahované ze vzorku. Poté bude konstruována knihovna klonů v E. coli a všechny klony budou studovány sekvenováním 16S rDNA o ~1500 párech bází. To umožňuje detekci organismů nazývaných „nekultivovatelné“, stejně jako organismy, které lze úspěšně kultivovat. Jakékoli „nekultivovatelné“ organismy, se kterými se často setkáváme, mohou být důležité; proto vyvineme primery a sondy pro jejich rychlou identifikaci a při pokusu o jejich kultivaci použijeme různé techniky (v několika případech jsme to již úspěšně provedli). Současně s tím, jak se provádějí molekulární přístupy, použijeme konvenční kulturní zpracování. Kulturní přístup poskytne organismy pro další studium (zejména pro testování antimikrobiální citlivosti) a poslouží jako současný standard pro srovnání s novějšími molekulárními přístupy. Kultivace bude provedena semikvantitativně a identifikace bude provedena sekvenováním 16S rDNA doplněným fenotypovým testováním, jak je uvedeno. Kulturní přístup obvykle trvá několik dní, než se izolují organismy v čisté kultuře.

Tyto dva molekulární přístupy budou porovnány s konvenčním kulturním přístupem z hlediska detekovaných organismů; každý vzorek bude studován všemi technikami pro srovnávací účely.

Relevance: Rychlost různých identifikačních schémat uvedených výše jasně ukazuje, že bychom byli schopni poskytnout přesnou, kvantitativní identifikaci (přesnější než konvenční kulturní přístup) mnohem dříve, než to bylo možné v minulosti. To by mělo vést k mnohem dřívější aplikaci nejvhodnější terapie a minimalizovat empirické používání našich nejsilnějších látek. To pravděpodobně povede ke zlepšení klinického výsledku, menší šanci na antimikrobiální rezistenci a také k úspoře nákladů. Poskytne nám mnohem přesnější obrázek o infekční flóře různých operačních ran a vzoru antimikrobiální citlivosti těchto organismů. Dozvíme se, zda, stejně jako u infekcí popálenin, kvantitativní studie tkáňových biopsií poskytne lepší obraz o skutečné infekční flóře než konvenční kultury ran. Dozvíme se, zda jsou „nekultivovatelné“ bakterie (které ve skutečnosti tvoří největší procento původní flóry střeva a horních cest dýchacích) klinicky důležité či nikoliv. Nakonec vyvineme úplnější sadu primerů/sond pro zlepšení molekulárního přístupu.