Hurtig identifikation af nøglepatogener ved sårinfektion med molekylære midler

Baggrund: Sårinfektioner er typisk blandede, med både anaerobe og ikke-anaerobe bakterier til stede, og der er normalt flere anaerobe end aerobe (f.eks. ved perforeret eller gangrenøs blindtarmsbetændelse har vi i gennemsnit fundet 9 anaerobe og 3 aerobe). Mange kliniske laboratorier udfører begrænset anaerob bakteriologi ved at bruge kommercielle kits baseret på utilstrækkelige fænotypiske egenskaber og unøjagtig taksonomi. Som følge heraf skal læger og kirurger behandle sårinfektioner empirisk og har en tendens til at bruge lægemidler, der er aktive mod de mest resistente anaerober, hvilket fører til øget resistens over for antimikrobielle stoffer. Molekylære teknikker, der nu er tilgængelige, tillader nøjagtig og hurtig karakterisering af mikroorganismer, både aerobe og anaerobe.

Formål/hypotese: Brugen af ​​molekylærbiologiske teknikker vil give identifikation af de mikroorganismer, der er ansvarlige for sårinfektion både hurtigere og mere præcist. Den nuværende konventionelle metode til dyrkning og identifikation ved fænotypisk testning er langsom og unøjagtig.

Specifikke mål: 1) Udvikle en hurtig identifikationsmetode, som omfatter kvantificering, for vigtige sårpatogener, 2) Analysere bakterieflora af sårinfektion ved molekylære midler og ved konventionel dyrkning; både vævsbiopsier og pus vil blive undersøgt ved begge metoder, 3) Bestem forekomsten og betydningen af ​​den såkaldte "udyrkelige" flora.

Studiedesign: Vi vil årligt studere 50 postoperative og traumatiske sårinfektioner og 50 lukkede bløddelsabscesser hos intravenøse stofmisbrugere fra en generel kirurgisk service på Olive View County Hospital, tilknyttet UCLA og VA Medical Center West Los Angeles, i samarbejde med Dr. Robert Bennion. Når det er muligt, vil vi få vævsbiopsier fra den aktive kant af såret til behandling sammen med pus fra såret.

Vi vil udvikle artsspecifikke primere/prober til organismer, der ses i forskellige typer sårinfektioner baseret på information om floraen af ​​sårinfektion opnået fra tidligere undersøgelser af vores gruppe og andre og suppleret med primere/prober fremstillet af kulturisolater, der ikke tidligere er stødt på. Primerne og proberne vil blive brugt i en high-throughput procedure (real-time PCR), der tillader hurtig identifikation og kvantificering af organismer. Hele proceduren, inklusive både DNA-ekstraktion og real-time PCR, kan gennemføres inden for 5 timer for én prøve. Flere prøver kan udføres samtidigt. Selvom det kan være nødvendigt at starte behandlingen empirisk, vil det være muligt at skifte til mere passende antimikrobielle midler, når de bakteriologiske data bliver tilgængelige om 5 timer. Samtidig vil vi bruge en anden molekylær tilgang, 16S rRNA-genkloning, til at analysere den samlede flora af prøven. Vi vil først amplificere 16S rRNA-gener ved hjælp af universelle (alle bakterier) primere ved PCR af DNA ekstraheret fra prøven. Derefter vil et klonbibliotek blive konstrueret i E. coli, og alle kloner vil blive undersøgt ved 16S rDNA-sekventering af ~1500 basepar. Dette tillader påvisning af organismer, der kaldes "ukultiverbare", såvel som organismer, der kan dyrkes med succes. Eventuelle "udyrkelige" organismer, der ofte stødes på, kan være vigtige; derfor vil vi udvikle primere og prober til deres hurtige identifikation, og vi vil bruge en række forskellige teknikker til at forsøge at dyrke disse (vi har gjort dette med succes i nogle få tilfælde allerede). Samtidig med at de molekylære tilgange bliver gjort, vil vi bruge konventionel kulturel bearbejdning. Den kulturelle tilgang vil give organismer til yderligere undersøgelse (især til antimikrobiel modtagelighedstest) og vil tjene som den nuværende standard for sammenligning med de nyere molekylære tilgange. Dyrkning vil blive udført semikvantitativt, og identifikation vil blive udført ved 16S rDNA-sekventering suppleret med fænotypisk testning som angivet. Den kulturelle tilgang tager typisk flere dage at isolere organismerne i ren kultur.

De to molekylære tilgange vil blive sammenlignet med den konventionelle kulturelle tilgang med hensyn til påviste organismer; hver prøve vil blive undersøgt med alle teknikker til sammenligningsformål.

Relevans: Hastigheden af ​​de forskellige identifikationsskemaer angivet ovenfor viser tydeligt, at vi ville være i stand til at levere nøjagtig, kvantitativ identifikation (mere nøjagtig end ved den konventionelle kulturelle tilgang) meget hurtigere, end det har været muligt tidligere. Dette skulle føre til meget tidligere anvendelse af den mest passende terapi og minimere empirisk brug af vores mest kraftfulde midler. Dette vil sandsynligvis resultere i forbedret klinisk resultat, mindre chance for antimikrobiel resistens og også omkostningsbesparelser. Det vil give os et meget mere præcist billede af den inficerende flora af forskellige operationssår og disse organismers antimikrobielle modtagelighedsmønster. Vi vil lære, om kvantitativ undersøgelse af vævsbiopsier, som ved brandsårinfektioner, vil give et bedre billede af den sande inficerende flora end konventionelle sårkulturer. Vi vil lære, om "udyrkelige" bakterier (som faktisk udgør den største procentdel af den oprindelige flora i tarmen og de øvre luftveje) er vigtige klinisk eller ej. Endelig vil vi udvikle et mere komplet sæt af primere/prober for at forbedre den molekylære tilgang.