Haavainfektioiden tärkeimpien patogeenien nopea tunnistaminen molekyylikeinoilla

Tausta: Haavainfektiot ovat tyypillisesti sekalaisia, ja niissä on sekä anaerobisia että ei-anaerobisia bakteereja, ja anaerobeja on yleensä enemmän kuin aerobeja (esim. rei'itetyssä tai gangrenoottisessa umpilisäkkeentulehduksessa on löydetty keskimäärin 9 anaerobia ja 3 aerobia). Monet kliiniset laboratoriot tekevät rajoitettua anaerobista bakteriologiaa käyttämällä kaupallisia sarjoja, jotka perustuvat riittämättömiin fenotyyppisiin ominaisuuksiin ja epätarkkoihin taksonomiaan. Tämän seurauksena lääkäreiden ja kirurgien on hoidettava haavainfektioita empiirisesti ja käytettävä lääkkeitä, jotka ovat aktiivisia vastustuskykyisimpiä anaerobeja vastaan, mikä johtaa lisääntyneeseen vastustuskykyyn mikrobilääkkeitä vastaan. Nyt saatavilla olevat molekyylitekniikat mahdollistavat mikro-organismien, sekä aerobisten että anaerobisten, tarkan ja nopean karakterisoinnin.

Tavoite/hypoteesi: Molekyylibiologian tekniikoiden käyttö tunnistaa haavainfektiosta vastuussa olevat mikro-organismit sekä nopeammin että tarkemmin. Nykyinen perinteinen viljely- ja tunnistamismenetelmä fenotyyppitestauksella on hidas ja epätarkka.

Erityiset tavoitteet: 1) Kehittää nopea tunnistusmenetelmä, joka sisältää kvantifioinnin tärkeille haavapatogeeneille, 2) Analysoida haavainfektion bakteerifloora molekyylikeinoilla ja tavanomaisella viljelyllä; sekä kudosbiopsiat että mätä tutkitaan molemmilla menetelmillä. 3) Selvitä niin kutsutun "viljelimättömän" kasviston esiintyvyys ja merkitys.

Tutkimuksen suunnittelu: Tutkimme 50 leikkauksen jälkeistä ja traumaattista haavainfektiota ja 50 suljettua pehmytkudospaiseet suonensisäisten huumeiden väärinkäyttäjillä vuosittain UCLA:n ja VA Medical Centerin West Los Angelesin kanssa sidoksissa olevan Olive View County Hospitalin yleiskirurgisesta palvelusta. Tri Robert Bennion. Aina kun mahdollista, otamme haavan aktiivisesta reunasta kudosbiopsiat käsittelyä varten sekä mätä haavasta.

Kehitämme lajikohtaisia ​​alukkeita/koettimia erityyppisissä haavatulehduksissa kohdatuille organismeille perustuen tietoon haavainfektiofloorasta, joka on saatu ryhmämme ja muiden aiemmista tutkimuksista ja täydennettynä alukkeilla/koettimilla, jotka on valmistettu kulttuuriisolaateista, joita ei ole aikaisemmin tehty. kohdannut. Alukkeita ja koettimia käytetään korkean suorituskyvyn menettelyssä (reaaliaikainen PCR), joka mahdollistaa organismien nopean tunnistamisen ja kvantifioinnin. Koko toimenpide, mukaan lukien sekä DNA:n uutto että reaaliaikainen PCR, voidaan suorittaa 5 tunnissa yhden näytteen osalta. Useita näytteitä voidaan tehdä samanaikaisesti. Vaikka hoito saattaa olla tarpeen aloittaa empiirisesti, on mahdollista vaihtaa sopivampiin mikrobilääkkeisiin, kun bakteriologiset tiedot ovat saatavilla 5 tunnin kuluessa. Samanaikaisesti hyödynnämme toista molekulaarista lähestymistapaa, 16S rRNA-geenin kloonausta, analysoidaksemme näytteen kokonaisflooraa. Monistamme ensin 16S-rRNA-geenit käyttämällä universaaleja (kaikki bakteerit) alukkeita näytteestä uutetun DNA:n PCR:llä. Sitten kloonikirjasto konstruoidaan E. colissa ja kaikkia klooneja tutkitaan ~1500 emäsparin 16S-rDNA-sekvensoinnilla. Tämä mahdollistaa "viljelykelvottomaksi kelpaamattomien" organismien havaitsemisen sekä organismien, joita voidaan viljellä onnistuneesti. Kaikki "viljelykelvottomat" organismit, joita tavataan usein, voivat olla tärkeitä; siksi kehitämme alukkeita ja koettimia niiden nopeaa tunnistamista varten ja käytämme erilaisia ​​tekniikoita yrittääksemme viljellä niitä (olemme tehneet tämän onnistuneesti jo muutamassa tapauksessa). Samaan aikaan kun molekyylipainotteisia lähestymistapoja tehdään, käytämme perinteistä kulttuurikäsittelyä. Kulttuurinen lähestymistapa tarjoaa organismeja lisätutkimuksiin (erityisesti antimikrobisen herkkyyden testaamiseen) ja toimii nykyisenä standardina vertailussa uudempiin molekyylimenetelmiin. Viljely tehdään semikvantitatiivisesti ja tunnistus tehdään 16S-rDNA-sekvensoinnilla, jota täydennetään fenotyyppitestauksella, kuten on osoitettu. Kulttuurinen lähestymistapa kestää tyypillisesti useita päiviä organismien eristämiseen puhtaassa viljelmässä.

Näitä kahta molekulaarista lähestymistapaa verrataan tavanomaiseen kulttuuriseen lähestymistapaan havaittujen organismien suhteen; jokainen näyte tutkitaan kaikilla tekniikoilla vertailutarkoituksiin.

Relevanssi: Edellä esitettyjen erilaisten tunnistusmenetelmien nopeus osoittaa selvästi, että pystyisimme tarjoamaan tarkan, kvantitatiivisen tunnistamisen (täsmällisemmin kuin perinteisellä kulttuurisella lähestymistavalla) paljon aikaisemmin kuin on ollut mahdollista. Tämän pitäisi johtaa sopivimman hoidon paljon aikaisempaan soveltamiseen ja minimoida tehokkaimpien aineidemme empiirinen käyttö. Tämä todennäköisesti johtaa parempaan kliiniseen lopputulokseen, pienempään mahdollisuuteen mikrobilääkeresistenssiin ja myös kustannussäästöihin. Se antaa meille paljon tarkemman kuvan erilaisten leikkaushaavojen tartuttavasta kasvistosta ja näiden organismien herkkyydestä mikrobilääkkeille. Opimme, antaako kudosbiopsioiden kvantitatiivinen tutkimus, kuten palovammojen infektioissa, paremman kuvan todellisesta infektoivasta kasvistosta kuin perinteiset haavaviljelmät. Opimme ovatko "viljelykelvottomat" bakteerit (jotka todella muodostavat suurimman osan suolen ja ylempien hengitysteiden alkuperäisestä kasvistosta) kliinisesti tärkeitä vai eivät. Lopuksi kehitämme täydellisemmän sarjan alukkeita/koettimia molekyylisen lähestymistavan parantamiseksi.