Identificación rápida de patógenos clave en la infección de heridas por medios moleculares

Antecedentes: las infecciones de heridas suelen ser mixtas, con presencia de bacterias tanto anaerobias como no anaerobias y suele haber más anaerobios que aerobios (por ejemplo, en la apendicitis perforada o gangrenosa, hemos encontrado una media de 9 anaerobios y 3 aerobios). Muchos laboratorios clínicos realizan bacteriología anaerobia limitada, utilizando kits comerciales basados ​​en características fenotípicas inadecuadas y taxonomía imprecisa. Como resultado, los médicos y cirujanos deben tratar las infecciones de heridas empíricamente y tienden a usar fármacos activos contra los anaerobios más resistentes, lo que conduce a una mayor resistencia a los antimicrobianos. Las técnicas moleculares ahora disponibles permiten una caracterización precisa y rápida de microorganismos, tanto aerobios como anaerobios.

Objetivo/Hipótesis: El uso de técnicas de biología molecular permitirá identificar los microorganismos responsables de la infección de heridas de forma más rápida y precisa. El método convencional actual de cultivo e identificación mediante pruebas fenotípicas es lento e impreciso.

Objetivos específicos: 1) Desarrollar un método de identificación rápida, que incluya la cuantificación, para importantes patógenos de heridas, 2) Analizar la flora bacteriana de la infección de heridas por medios moleculares y por cultivo convencional; tanto las biopsias de tejido como el pus serán estudiados por ambas metodologías, 3) Determinar la incidencia y significado de la denominada flora "no cultivable".

Diseño del estudio: Estudiaremos anualmente 50 infecciones de heridas postoperatorias y traumáticas y 50 abscesos de tejidos blandos cerrados en drogadictos por vía intravenosa, de un servicio de cirugía general en el Hospital del Condado de Olive View, afiliado a UCLA y el Centro Médico VA West Los Ángeles, en colaboración con Dr. Robert Bennion. Siempre que sea posible, obtendremos biopsias de tejido del borde activo de la herida para su procesamiento, junto con el pus de la herida.

Desarrollaremos cebadores/sondas específicos de especies para los organismos que se encuentran en diferentes tipos de infecciones de heridas en base a la información sobre la flora de la infección de heridas obtenida de estudios previos realizados por nuestro grupo y otros y complementada con cebadores/sondas hechos de cultivos aislados que no se habían identificado anteriormente. encontrado. Los cebadores y las sondas se utilizarán en un procedimiento de alto rendimiento (PCR en tiempo real) que permite una rápida identificación y cuantificación de organismos. El procedimiento completo, incluida la extracción de ADN y la PCR en tiempo real, se puede completar en 5 horas para una muestra. Se pueden realizar varias muestras al mismo tiempo. Si bien puede ser necesario comenzar la terapia empíricamente, será posible cambiar a agentes antimicrobianos más apropiados cuando los datos bacteriológicos estén disponibles en 5 horas. Al mismo tiempo, utilizaremos otro enfoque molecular, la clonación del gen 16S rRNA, para analizar la flora total de la muestra. Primero amplificaremos los genes 16S rRNA utilizando cebadores universales (todas las bacterias) mediante PCR de ADN extraído de la muestra. Luego, se construirá una biblioteca de clones en E. coli y todos los clones se estudiarán mediante secuenciación de ADNr 16S de ~1500 pares de bases. Esto permite la detección de organismos llamados "no cultivables", así como organismos que se pueden cultivar con éxito. Cualquier organismo "no cultivable" que se encuentre con frecuencia puede ser importante; por lo tanto, desarrollaremos cebadores y sondas para su rápida identificación y usaremos una variedad de técnicas para intentar cultivarlos (ya lo hemos hecho con éxito en algunos casos). Al mismo tiempo que se realizan los enfoques moleculares, utilizaremos el procesamiento cultural convencional. El enfoque cultural proporcionará organismos para estudios adicionales (especialmente para las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos) y servirá como estándar actual para la comparación con los enfoques moleculares más nuevos. El cultivo se realizará de forma semicuantitativa y la identificación se realizará mediante secuenciación de ADNr 16S complementada con pruebas fenotípicas según se indica. El enfoque cultural generalmente toma varios días para aislar los organismos en cultivo puro.

Los dos enfoques moleculares se compararán con el enfoque cultural convencional en términos de organismos detectados; cada espécimen será estudiado por todas las técnicas, con fines comparativos.

Relevancia: La velocidad de los diversos esquemas de identificación indicados anteriormente muestra claramente que seríamos capaces de proporcionar una identificación cuantitativa precisa (más precisa que mediante el enfoque cultural convencional) mucho antes de lo que ha sido posible en el pasado. Esto debería conducir a una aplicación mucho más temprana de la terapia más adecuada y minimizar el uso empírico de nuestros agentes más poderosos. Es probable que esto resulte en un mejor resultado clínico, menos posibilidades de resistencia a los antimicrobianos y también en ahorros de costos. Nos proporcionará una imagen mucho más precisa de la flora infecciosa de varias heridas quirúrgicas y el patrón de susceptibilidad antimicrobiana de estos organismos. Aprenderemos si, como en las infecciones de heridas por quemadura, el estudio cuantitativo de las biopsias de tejido proporcionará una mejor imagen de la verdadera flora infectante que los cultivos convencionales de heridas. Aprenderemos si las bacterias "no cultivables" (que en realidad constituyen el mayor porcentaje de la flora autóctona del intestino y las vías respiratorias superiores) son clínicamente importantes o no. Finalmente, desarrollaremos un conjunto más completo de cebadores/sondas para mejorar el enfoque molecular.