Szybka identyfikacja kluczowych patogenów w zakażeniach ran za pomocą środków molekularnych

Tło: Infekcje ran są zwykle mieszane, obecne są zarówno bakterie beztlenowe, jak i beztlenowe, a beztlenowców jest zwykle więcej niż tlenowców (na przykład w perforowanym lub zgorzelinowym zapaleniu wyrostka robaczkowego wykryliśmy średnio 9 beztlenowców i 3 tlenowce). Wiele laboratoriów klinicznych wykonuje ograniczoną bakteriologię beztlenową, używając komercyjnych zestawów opartych na nieodpowiednich cechach fenotypowych i niedokładnej taksonomii. W rezultacie lekarze i chirurdzy muszą leczyć infekcje ran empirycznie i często stosować leki działające na najbardziej oporne beztlenowce, co prowadzi do zwiększonej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Obecnie dostępne techniki molekularne pozwalają na dokładną i szybką charakterystykę mikroorganizmów, zarówno tlenowych, jak i beztlenowych.

Cel/hipoteza: Zastosowanie technik biologii molekularnej umożliwi szybszą i dokładniejszą identyfikację mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcję rany. Obecna konwencjonalna metoda hodowli i identyfikacji za pomocą testów fenotypowych jest powolna i niedokładna.

Cele szczegółowe: 1) Opracowanie szybkiej metody identyfikacji, w tym ilościowej, ważnych patogenów rany, 2) Analiza flory bakteryjnej infekcji rany metodami molekularnymi i konwencjonalnymi hodowlami; zarówno biopsje tkanek, jak i ropa będą badane obiema metodologiami, 3) Określenie częstości występowania i znaczenia tak zwanej flory „nienadające się do uprawy”.

Projekt badania: Co roku będziemy badać 50 infekcji ran pooperacyjnych i urazowych oraz 50 zamkniętych ropni tkanek miękkich u osób nadużywających narkotyków dożylnie, z ogólnych usług chirurgicznych w Olive View County Hospital, stowarzyszonym z UCLA i VA Medical Center West Los Angeles, we współpracy z dr Robert Bennion. W miarę możliwości będziemy pobierać biopsje tkanek z aktywnego brzegu rany do przetworzenia wraz z ropą z rany.

Opracujemy specyficzne dla gatunku startery/sondy dla organizmów spotykanych w różnych typach infekcji ran w oparciu o informacje o florze infekcji rany uzyskane z poprzednich badań przeprowadzonych przez naszą grupę i inne osoby oraz uzupełnione starterami/sondami wykonanymi z izolatów kulturowych, które nie były wcześniej napotkany. Startery i sondy zostaną wykorzystane w wysokowydajnej procedurze (PCR w czasie rzeczywistym), która umożliwi szybką identyfikację i oznaczenie ilościowe organizmów. Całą procedurę, w tym zarówno ekstrakcję DNA, jak i reakcję PCR w czasie rzeczywistym, można przeprowadzić w ciągu 5 godzin dla jednej próbki. Można wykonać wiele próbek jednocześnie. Chociaż konieczne może być empiryczne rozpoczęcie leczenia, zmiana na bardziej odpowiednie środki przeciwdrobnoustrojowe będzie możliwa, gdy dane bakteriologiczne staną się dostępne w ciągu 5 godzin. Jednocześnie wykorzystamy inne podejście molekularne, klonowanie genu 16S rRNA, do analizy całej flory próbki. Najpierw zamplifikujemy geny 16S rRNA przy użyciu uniwersalnych (wszystkich bakterii) starterów metodą PCR DNA wyekstrahowanego z próbki. Następnie biblioteka klonów zostanie skonstruowana w E. coli i wszystkie klony zostaną zbadane przez sekwencjonowanie 16S rDNA ~1500 par zasad. Pozwala to na wykrycie organizmów zwanych „nienadających się do uprawy”, a także organizmów, które można z powodzeniem hodować. Wszelkie często spotykane organizmy „nienadające się do uprawy” mogą być ważne; dlatego opracujemy startery i sondy do ich szybkiej identyfikacji i użyjemy różnych technik, aby spróbować je wyhodować (z powodzeniem zrobiliśmy to już w kilku przypadkach). W tym samym czasie, gdy wykonywane są podejścia molekularne, będziemy stosować konwencjonalne przetwarzanie kulturowe. Podejście kulturowe zapewni organizmy do dodatkowych badań (zwłaszcza do oznaczania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe) i posłuży jako aktualny standard do porównań z nowszymi podejściami molekularnymi. Hodowla zostanie przeprowadzona półilościowo, a identyfikacja zostanie przeprowadzona przez sekwencjonowanie 16S rDNA uzupełnione testami fenotypowymi, jak wskazano. Podejście kulturowe zwykle zajmuje kilka dni, aby wyizolować organizmy w czystej kulturze.

Dwa podejścia molekularne zostaną porównane z konwencjonalnym podejściem kulturowym pod względem wykrytych organizmów; każdy okaz zostanie zbadany wszystkimi technikami w celach porównawczych.

Trafność: Szybkość różnych schematów identyfikacji wskazanych powyżej wyraźnie pokazuje, że bylibyśmy w stanie zapewnić dokładną, ilościową identyfikację (dokładniejszą niż w przypadku konwencjonalnego podejścia kulturowego) znacznie wcześniej niż było to możliwe w przeszłości. Powinno to prowadzić do znacznie wcześniejszego zastosowania najbardziej odpowiedniej terapii i zminimalizowania empirycznego użycia naszych najpotężniejszych środków. Prawdopodobnie doprowadzi to do lepszych wyników klinicznych, mniejszego ryzyka oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, a także oszczędności. Dostarczy nam to znacznie dokładniejszego obrazu flory infekcyjnej różnych ran chirurgicznych oraz wzorca wrażliwości tych organizmów na środki przeciwdrobnoustrojowe. Dowiemy się, czy, podobnie jak w przypadku infekcji ran oparzeniowych, ilościowe badanie biopsji tkanek zapewni lepszy obraz prawdziwej flory infekcyjnej niż konwencjonalne hodowle ran. Dowiemy się, czy bakterie „nienadające się do hodowli” (które faktycznie stanowią największy procent autochtonicznej flory jelit i górnych dróg oddechowych) mają znaczenie kliniczne, czy też nie. Na koniec opracujemy pełniejszy zestaw starterów/sond, aby udoskonalić podejście molekularne.