Identificazione rapida di agenti patogeni chiave nell'infezione della ferita mediante mezzi molecolari

Contesto: le infezioni delle ferite sono tipicamente miste, con la presenza di batteri sia anaerobi che non anaerobi e di solito ci sono più anaerobi che aerobi (ad esempio, nell'appendicite perforata o cancrenosa, abbiamo trovato una media di 9 anaerobi e 3 aerobi). Molti laboratori clinici eseguono una batteriologia anaerobica limitata, utilizzando kit commerciali basati su caratteristiche fenotipiche inadeguate e tassonomia imprecisa. Di conseguenza, medici e chirurghi devono trattare empiricamente le infezioni delle ferite e tendono a utilizzare farmaci attivi contro gli anaerobi più resistenti, il che porta a una maggiore resistenza agli antimicrobici. Le tecniche molecolari ora disponibili consentono una caratterizzazione accurata e rapida dei microrganismi, sia aerobi che anaerobi.

Obiettivo/Ipotesi: L'uso di tecniche di biologia molecolare consentirà di identificare i microrganismi responsabili dell'infezione della ferita in modo più rapido e accurato. L'attuale metodo convenzionale di coltura e identificazione mediante test fenotipico è lento e impreciso.

Obiettivi specifici: 1) Sviluppare un metodo di identificazione rapida, che includa la quantificazione, per importanti patogeni della ferita, 2) Analizzare la flora batterica dell'infezione della ferita mediante mezzi molecolari e mediante coltura convenzionale; con entrambe le metodologie saranno studiate sia le biopsie tissutali che il pus, 3) determinare l'incidenza e l'importanza della cosiddetta flora "incoltivabile".

Disegno dello studio: studieremo ogni anno 50 infezioni di ferite postoperatorie e traumatiche e 50 ascessi dei tessuti molli chiusi in tossicodipendenti per via endovenosa, da un servizio di chirurgia generale presso l'Olive View County Hospital, affiliato con UCLA e il VA Medical Center West Los Angeles, in collaborazione con Il dottor Robert Bennion. Quando possibile, otterremo biopsie tissutali dal bordo attivo della ferita per l'elaborazione, insieme al pus dalla ferita.

Svilupperemo primer/sonde specie-specifici per organismi che si incontrano in diversi tipi di infezioni della ferita sulla base delle informazioni sulla flora dell'infezione della ferita ottenute da studi precedenti dal nostro gruppo e altri e integrate con primer/sonde realizzati da isolati culturali non precedentemente incontrato. I primer e le sonde verranno utilizzati in una procedura ad alto rendimento (PCR in tempo reale) che consente una rapida identificazione e quantificazione degli organismi. L'intera procedura, inclusa sia l'estrazione del DNA che la PCR in tempo reale, può essere completata entro 5 ore per un campione. È possibile eseguire più campioni contemporaneamente. Sebbene possa essere necessario iniziare la terapia in modo empirico, sarà possibile passare ad agenti antimicrobici più appropriati quando i dati batteriologici saranno disponibili entro 5 ore. Allo stesso tempo, utilizzeremo un altro approccio molecolare, il clonaggio del gene 16S rRNA, per analizzare la flora totale del campione. Per prima cosa amplificheremo i geni 16S rRNA usando primer universali (tutti i batteri) mediante PCR del DNA estratto dal campione. Quindi, una libreria di cloni sarà costruita in E. coli e tutti i cloni saranno studiati mediante sequenziamento 16S rDNA di ~1500 paia di basi. Ciò consente il rilevamento di organismi definiti "incoltivabili", nonché di organismi che possono essere coltivati ​​con successo. Eventuali organismi "incoltivabili" che si incontrano frequentemente possono essere importanti; pertanto, svilupperemo primer e sonde per la loro rapida identificazione e utilizzeremo una varietà di tecniche per tentare di coltivarli (lo abbiamo già fatto con successo in alcuni casi). Contemporaneamente agli approcci molecolari, utilizzeremo l'elaborazione colturale convenzionale. L'approccio colturale fornirà organismi per ulteriori studi (soprattutto per i test di sensibilità antimicrobica) e servirà come standard attuale per il confronto con i nuovi approcci molecolari. La coltura sarà effettuata in modo semiquantitativo e l'identificazione sarà effettuata mediante sequenziamento del 16S rDNA integrato da test fenotipici come indicato. L'approccio culturale richiede in genere diversi giorni per isolare gli organismi in coltura pura.

I due approcci molecolari saranno confrontati con l'approccio colturale convenzionale in termini di organismi rilevati; ogni esemplare sarà studiato con tutte le tecniche, a fini comparativi.

Rilevanza: la velocità dei vari schemi di identificazione sopra indicati mostra chiaramente che saremmo in grado di fornire un'identificazione accurata e quantitativa (più accurata rispetto all'approccio culturale convenzionale) molto prima di quanto è stato possibile in passato. Ciò dovrebbe portare a un'applicazione molto più precoce della terapia più appropriata e ridurre al minimo l'uso empirico dei nostri agenti più potenti. È probabile che ciò si traduca in risultati clinici migliori, minori possibilità di resistenza antimicrobica e anche risparmi sui costi. Ci fornirà un quadro molto più accurato della flora infettante di varie ferite chirurgiche e del modello di suscettibilità antimicrobica di questi organismi. Impareremo se, come nelle infezioni delle ferite da ustione, lo studio quantitativo delle biopsie tissutali fornirà un quadro migliore della vera flora infettante rispetto alle colture convenzionali delle ferite. Impareremo se i batteri "incoltivabili" (che in realtà costituiscono la maggior percentuale della flora autoctona dell'intestino e delle prime vie respiratorie) sono clinicamente importanti oppure no. Infine, svilupperemo un set più completo di primer/sonde per migliorare l'approccio molecolare.