Identificação rápida de patógenos-chave na infecção de feridas por meios moleculares

Introdução: As infecções de feridas são tipicamente mistas, com bactérias anaeróbias e não anaeróbicas presentes e geralmente há mais anaeróbios do que aeróbios (por exemplo, na apendicite perfurada ou gangrenosa, encontramos uma média de 9 anaeróbios e 3 aeróbicos). Muitos laboratórios clínicos fazem bacteriologia anaeróbia limitada, usando kits comerciais baseados em características fenotípicas inadequadas e taxonomia imprecisa. Como resultado, médicos e cirurgiões devem tratar infecções de feridas empiricamente e tendem a usar drogas ativas contra os anaeróbios mais resistentes, o que leva ao aumento da resistência aos antimicrobianos. As técnicas moleculares agora disponíveis permitem a caracterização precisa e rápida de microorganismos, tanto aeróbicos quanto anaeróbicos.

Objetivo/Hipótese: O uso de técnicas de biologia molecular possibilitará a identificação dos microrganismos responsáveis ​​pela infecção da ferida de forma mais rápida e precisa. O método convencional atual de cultura e identificação por testes fenotípicos é lento e impreciso.

Objectivos Específicos: 1) Desenvolver um método de identificação rápida, incluindo quantificação, de importantes agentes patogénicos de feridas, 2) Analisar a flora bacteriana da infecção de feridas por meios moleculares e por cultura convencional; ambas as biópsias de tecido e pus serão estudadas por ambas as metodologias, 3) Determinar a incidência e importância da chamada flora "incultivável".

Desenho do estudo: Estudaremos 50 infecções de feridas traumáticas e pós-operatórias e 50 abscessos de tecidos moles fechados em usuários de drogas intravenosas anualmente, de um serviço de cirurgia geral no Olive View County Hospital, afiliado à UCLA e ao VA Medical Center West Los Angeles, em colaboração com Dr. Robert Bennion. Sempre que possível, obteremos biópsias de tecido da borda ativa da ferida para processamento, juntamente com o pus da ferida.

Desenvolveremos primers/sondas espécies-específicas para organismos que são encontrados em diferentes tipos de infecções de feridas com base em informações sobre a flora da infecção de feridas obtidas de estudos anteriores de nosso grupo e outros e suplementadas com primers/sondas feitas de isolados culturais não previamente encontrado. Os primers e sondas serão utilizados em um procedimento de alto rendimento (PCR em tempo real) que permite rápida identificação e quantificação de organismos. Todo o procedimento, incluindo extração de DNA e PCR em tempo real, pode ser concluído em 5 horas para uma amostra. Várias amostras podem ser feitas simultaneamente. Embora possa ser necessário iniciar a terapia empiricamente, será possível mudar para agentes antimicrobianos mais apropriados quando os dados bacteriológicos estiverem disponíveis em 5 horas. Paralelamente, utilizaremos outra abordagem molecular, a clonagem do gene 16S rRNA, para analisar a flora total da amostra. Vamos primeiro amplificar os genes 16S rRNA usando primers universais (todas as bactérias) por PCR de DNA extraído da amostra. Em seguida, uma biblioteca de clones será construída em E. coli e todos os clones serão estudados por sequenciamento 16S rDNA de ~1500 pares de bases. Isso permite a detecção de organismos chamados "incultiváveis", bem como organismos que podem ser cultivados com sucesso. Quaisquer organismos "não cultiváveis" encontrados com frequência podem ser importantes; portanto, desenvolveremos primers e sondas para sua identificação rápida e usaremos uma variedade de técnicas para tentar cultivá-los (já fizemos isso com sucesso em alguns casos). Ao mesmo tempo em que as abordagens moleculares estão sendo feitas, usaremos o processamento cultural convencional. A abordagem cultural fornecerá organismos para estudos adicionais (especialmente para testes de suscetibilidade antimicrobiana) e servirá como padrão atual para comparação com as abordagens moleculares mais recentes. A cultura será semiquantitativa e a identificação será feita por sequenciamento de 16S rDNA complementado por testes fenotípicos conforme indicado. A abordagem cultural normalmente leva vários dias para isolar os organismos em cultura pura.

As duas abordagens moleculares serão comparadas com a abordagem cultural convencional em termos de organismos detectados; cada espécime será estudado por todas as técnicas, para fins comparativos.

Relevância: A velocidade dos vários esquemas de identificação indicados acima mostra claramente que seríamos capazes de fornecer identificação precisa e quantitativa (mais precisa do que pela abordagem cultural convencional) muito mais cedo do que era possível no passado. Isso deve levar a uma aplicação muito mais precoce da terapia mais apropriada e minimizar o uso empírico de nossos agentes mais poderosos. É provável que isso resulte em melhor resultado clínico, menos chance de resistência antimicrobiana e economia de custos também. Ele nos fornecerá uma imagem muito mais precisa da flora infectante de várias feridas cirúrgicas e do padrão de suscetibilidade antimicrobiana desses organismos. Aprenderemos se, como nas infecções de queimaduras, o estudo quantitativo de biópsias de tecido fornecerá uma imagem melhor da verdadeira flora infectante do que as culturas de feridas convencionais. Aprenderemos se as bactérias "incultiváveis" (que na verdade compõem a maior porcentagem da flora nativa do intestino e do trato respiratório superior) são clinicamente importantes ou não. Por fim, desenvolveremos um conjunto mais completo de primers/sondas para aprimorar a abordagem molecular.