Schnelle Identifizierung von Schlüsselpathogenen bei Wundinfektionen durch molekulare Methoden

Hintergrund: Wundinfektionen sind typischerweise gemischt, wobei sowohl anaerobe als auch nicht-anaerobe Bakterien vorhanden sind, und es gibt normalerweise mehr Anaerobier als Aerobier (zum Beispiel haben wir bei perforierter oder gangränöser Blinddarmentzündung durchschnittlich 9 Anaerobier und 3 Aerobier gefunden). Viele klinische Labors führen begrenzte anaerobe Bakteriologie durch und verwenden kommerzielle Kits, die auf unzureichenden phänotypischen Eigenschaften und ungenauer Taxonomie basieren. Infolgedessen müssen Ärzte und Chirurgen Wundinfektionen empirisch behandeln und tendieren dazu, Arzneimittel einzusetzen, die gegen die resistentesten Anaerobier wirksam sind, was zu einer erhöhten Resistenz gegen antimikrobielle Mittel führt. Die jetzt verfügbaren molekularen Techniken erlauben eine genaue und schnelle Charakterisierung von Mikroorganismen, sowohl aerob als auch anaerob.

Ziel/Hypothese: Der Einsatz molekularbiologischer Techniken ermöglicht eine schnellere und genauere Identifizierung der für Wundinfektionen verantwortlichen Mikroorganismen. Die gegenwärtige herkömmliche Methode der Kultivierung und Identifizierung durch phänotypische Tests ist langsam und ungenau.

Spezifische Ziele: 1) Entwicklung einer schnellen Identifizierungsmethode, einschließlich Quantifizierung, für wichtige Wundpathogene, 2) Analyse der Bakterienflora einer Wundinfektion mit molekularen Mitteln und durch konventionelle Kultivierung; Sowohl Gewebebiopsien als auch Eiter werden mit beiden Methoden untersucht. 3) Bestimmen Sie das Vorkommen und die Bedeutung der sogenannten "nicht kultivierbaren" Flora.

Studiendesign: Wir werden jährlich 50 postoperative und traumatische Wundinfektionen und 50 geschlossene Weichteilabszesse bei intravenösen Drogenabhängigen von einem allgemeinen chirurgischen Dienst am Olive View County Hospital, das der UCLA und dem VA Medical Center West Los Angeles angegliedert ist, in Zusammenarbeit mit untersuchen Dr. Robert Bennion. Wenn möglich, werden wir Gewebebiopsien vom aktiven Wundrand zur Verarbeitung entnehmen, zusammen mit Eiter aus der Wunde.

Wir werden artspezifische Primer/Sonden für Organismen entwickeln, die bei verschiedenen Arten von Wundinfektionen angetroffen werden, basierend auf Informationen über die Flora der Wundinfektion, die aus früheren Studien unserer Gruppe und anderer gewonnen wurden, und ergänzt durch Primer/Sonden, die aus nicht früheren Kulturisolaten hergestellt wurden angetroffen. Die Primer und Sonden werden in einem Hochdurchsatzverfahren (Echtzeit-PCR) verwendet, das eine schnelle Identifizierung und Quantifizierung von Organismen ermöglicht. Das gesamte Verfahren, einschließlich DNA-Extraktion und Echtzeit-PCR, kann für eine Probe innerhalb von 5 Stunden abgeschlossen werden. Es können mehrere Proben gleichzeitig durchgeführt werden. Während es notwendig sein kann, die Therapie empirisch zu beginnen, ist es möglich, auf geeignetere antimikrobielle Mittel umzusteigen, wenn die bakteriologischen Daten innerhalb von 5 Stunden vorliegen. Gleichzeitig werden wir einen anderen molekularen Ansatz, das Klonen des 16S-rRNA-Gens, verwenden, um die Gesamtflora der Probe zu analysieren. Wir werden zunächst 16S-rRNA-Gene unter Verwendung universeller Primer (alle Bakterien) durch PCR von aus der Probe extrahierter DNA amplifizieren. Dann wird eine Klonbibliothek in E. coli erstellt und alle Klone werden durch 16S-rDNA-Sequenzierung von ~1500 Basenpaaren untersucht. Dies ermöglicht den Nachweis von Organismen, die als "nicht kultivierbar" bezeichnet werden, sowie von Organismen, die erfolgreich kultiviert werden können. Alle "nicht kultivierbaren" Organismen, die häufig angetroffen werden, können wichtig sein; Daher werden wir Primer und Sonden für ihre schnelle Identifizierung entwickeln und versuchen, diese mit verschiedenen Techniken zu kultivieren (in einigen Fällen haben wir dies bereits erfolgreich getan). Gleichzeitig mit den molekularen Ansätzen werden wir die konventionelle kulturelle Verarbeitung verwenden. Der kulturelle Ansatz wird Organismen für zusätzliche Studien (insbesondere für antimikrobielle Empfindlichkeitstests) bereitstellen und als aktueller Standard für den Vergleich mit den neueren molekularen Ansätzen dienen. Die Kultur wird halbquantitativ durchgeführt und die Identifizierung erfolgt durch 16S-rDNA-Sequenzierung, ergänzt durch phänotypische Tests wie angegeben. Der kulturelle Ansatz dauert typischerweise mehrere Tage, um die Organismen in Reinkultur zu isolieren.

Die beiden molekularen Ansätze werden hinsichtlich der nachgewiesenen Organismen mit dem konventionellen kulturellen Ansatz verglichen; Jedes Exemplar wird zu Vergleichszwecken mit allen Techniken untersucht.

Relevanz: Die oben angegebene Geschwindigkeit der verschiedenen Identifikationsschemata zeigt deutlich, dass wir in der Lage wären, eine genaue, quantitative Identifikation (genauer als durch den herkömmlichen kulturellen Ansatz) viel früher als in der Vergangenheit möglich zu machen. Dies sollte zu einer viel früheren Anwendung der am besten geeigneten Therapie führen und den empirischen Einsatz unserer stärksten Wirkstoffe minimieren. Dies wird wahrscheinlich zu einem verbesserten klinischen Ergebnis, einer geringeren Wahrscheinlichkeit für antimikrobielle Resistenzen und auch zu Kosteneinsparungen führen. Es wird uns ein viel genaueres Bild der infizierenden Flora verschiedener chirurgischer Wunden und des antimikrobiellen Empfindlichkeitsmusters dieser Organismen liefern. Wir werden erfahren, ob, wie bei Brandwundeninfektionen, die quantitative Untersuchung von Gewebebiopsien ein besseres Bild der wahren Infektionsflora liefert als herkömmliche Wundkulturen. Wir erfahren, ob „unkultivierbare“ Bakterien (die eigentlich den größten Anteil an der einheimischen Flora des Darms und der oberen Atemwege ausmachen) klinisch von Bedeutung sind oder nicht. Schließlich werden wir einen vollständigeren Satz von Primern/Sonden entwickeln, um den molekularen Ansatz zu verbessern.