集中治療室 (ICU) における人工呼吸器関連肺炎 (VAP)

前書き

人工呼吸器関連肺炎 (VAP) は通常、気管内挿管および人工呼吸から 48 時間後に発症する院内肺炎を指します。集中治療室。 人工呼吸器の使用期間、慢性肺疾患の存在、敗血症、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、神経疾患、外傷など、いくつかの危険因子が VAP に関連していると報告されています。 免疫系は感染から宿主を防御します。 防御免疫は、自然免疫と適応免疫に分けることができます。 自然免疫応答は、宿主の最初の防御バリアとして進化し、侵入者を迅速に破壊または制限するために、即時ではあるが非特異的な免疫応答を開始します。 生来の防御メカニズムは、外部上皮、粘膜表面、細胞 (NK 細胞、食細胞)、および補体系です。

適応免疫は、T (細胞性) および B (体液性) 細胞を介した応答を含む二次防御です。 これは特異的であり、自己ではなく病原体のみを標的とし、再感染に対する長期にわたる免疫を維持するための記憶を持っています. 自然免疫系は、適応免疫の優れた特異性を欠いていますが、自己と非自己を区別することができます。 自然免疫認識は、微生物病原体に関連する保存された分子パターン (病原体関連分子パターン、PAMP) を認識するパターン認識受容体 (PRR) と呼ばれる生殖細胞系列にコードされた受容体のシステムによって媒介されます。 これらの受容体は、さまざまな誘導可能な免疫応答遺伝子の発現を制御するシグナル伝達経路に結合しています。

TLR は、自然免疫応答と適応免疫応答の両方を制御します。 TLR による炎症反応は、アダプター分子 MyD88 によって媒介される共通のシグナル伝達経路に依存しています。 TLR 発現は、マクロファージ、好中球、樹状細胞、腸、肺および真皮に由来する上皮細胞、B リンパ球および T リンパ球などのさまざまな細胞で観察されます。 (LPS) は、敗血症を誘発する可能性があるグラム陰性菌の主要な細胞壁成分です。 TLR2 は最も強力な受容体であり、バクテリア、酵母、菌類、寄生虫、ウイルスからの多種多様な PAMP を認識します。 TLR9 は、細菌 DNA に存在するメチル化されていない CpG モチーフを認識します。

敗血症症候群は、院内感染、特にグラム陰性肺炎の発症によってしばしば複雑化します。 調査結果は、TLR9 が肺の細菌性病原体に対する保護的な先天性応答の生成において重要なシグナルとして機能し、グラム陰性菌性病原体に対する効果的な先天性免疫応答に必要であることを示しています。 メチル化されていない CpG モチーフは、細菌のゲノム DNA では一般的ですが、脊椎動物のゲノム DNA では一般的ではありません。 CpG モチーフの認識は、宿主の防御機構を活性化し、自然免疫および獲得免疫応答を引き起こします。 TLR-9 を発現する細胞は形質細胞様樹状細胞 (PDC) と B 細胞であり、結果として Th1 様の炎症誘発性サイトカイン、インターフェロン、ケモカインを生成します。 TLR-9 の活性化は、Th1 炎症誘発性サイトカインである a) サイトカイン (IL-12、IL-1、IL-6、IL-8)、インターフェロン (IFN)-γ、および腫瘍壊死因子 (TNF-)α の産生を誘導します。 b) 免疫抑制を誘導する Th2 炎症誘発性サイトカインである IL-10 および IL-4。

Th1 サイトカインは、マクロファージ、NK 細胞、および好中球の炎症および活性化において中心的な役割を果たします。 Th2 サイトカインは Th1 免疫応答を阻害します。 これにより、全身性全身性炎症反応症候群が引き起こされます。 また、toll-like receptors-2 (TLR2) および -4 (TLR4) は、慢性閉塞性肺疾患 (COPD) において重要な役割を果たします。 グラム (-) およびグラム (+) 細菌の LPS によるそれらの活性化は、好中球、NK 細胞、T 細胞、B 細胞、および炎症性サイトカインの活性化につながります。 慢性疾患では、調節不全の炎症がこれらのシステムを一定の活性化状態に維持し、組織の損傷や進行性疾患を引き起こす可能性があります。 TLR システムを理解することは、宿主の免疫応答を操作するための非常に貴重な機会を提供するはずです。

目的

1. VAP の病因における CD4+ και CD8+ Τ リンパ球の役割を調査および解明すること。 また、ICU の患者が VAP を発症したときのサイトカイン IL-4 および IFN-γ のレベルと、T リンパ球の亜集団の変化。
2. マクロファージのアポトーシスと VAP 患者の食細胞に対する能力を評価します。
3. TLR-2、TLR-4、および TLR-9 遺伝子の発現と可能性のある多型を研究する。

VAP に対する免疫応答を理解することで、免疫応答を調節する免疫療法プロトコルを作成することができます。

方法

材料および方法

気管支肺胞洗浄処理

初日に、各患者の血液サンプルで、気管支肺胞洗浄液 (BAL) および気管気管支吸引液 (TBA) が採取されます。 気管支鏡検査は、診断および治療目的で気道の内部を視覚化する技術です。 気管支鏡は、通常は鼻または口から気道に挿入されますが、場合によっては気管切開から挿入されます。 これにより、開業医は患者の気道に異物、出血、腫瘍、炎症などの異常がないか調べることができます。 標本は、生検、体液 (気管支肺胞洗浄)、または気管支内ブラッシングなど、肺の内側から採取することができます。 BAL は通常、肺疾患を診断するために実行されます。 特に、免疫系に問題がある人の感染症、人工呼吸器を使用している人の肺炎、ある種の肺がんの診断に BAL が一般的に使用されています。 BAL は、肺 (T 細胞集団) の細胞または病原体レベルをサンプリングする手段として、免疫学的研究でよく使用されます。 検体は、VAP の診断から 48 時間後に再度採取することができます。 BALを10%FBS-RPMIcに入れ、400gで5分間遠心分離機にかけ、次にRPMI-1640と10%FBSを加える。 細胞の数と種類は、May-Grunwald-Giemsa 染色、およびフローサイトメトリーによる亜集団によって定義されます。

PBMCの分離

ヒトリンパ球は、炭水化物ポリマー Ficoll (Ficoll Histopaque、Sigma、Cat 1077-1) を用いた密度遠心分離によって、末梢血から最も容易に分離できます。 これにより、赤血球とほとんどの多形核白血球または顆粒球が枯渇した界面に単核細胞の集団が生じます。 得られた集団は、末梢血単核細胞と呼ばれ、主にリンパ球と単球で構成されています。 希釈した抗凝固処理済み血液を Ficoll の上に重ね、400g、20℃で 30 分間遠心分離します (低速加速、ブレーキなし)。 赤血球、多形核白血球、または顆粒球はフィコールからの密度が高く、チューブの底にあります。 しかし、いくつかの単球と一緒にリンパ球からなる単核細胞は、その上にバンドを形成し、界面で回収することができます. 細胞を１ｍＭのＥＤＴＡを含む１ｘＰＢＳを用いて３回洗浄し、フィコールおよび血小板を除去する。

抗体標識

抗 CD3-FITC (フルオレセイン イソチオシアネート)、抗 CD8-PE (フィコエリトリン)、抗 CD4-PE、抗 IFN-γ および抗 IL-4、抗 CD4、抗 CD8、およびコントロール IgG-FITC および-PE は細胞の標識に使用されます。 フルオレセインの反応性誘導体であるフルオレセイン イソチオシアネート (FITC) は、他の非蛍光分子に化学的に結合して、さまざまなアプリケーション向けの新しい蛍光分子を作成する最も一般的な蛍光体の 1 つです。 DAKOシステムが使用されます。 染色のために、メーカーの指示に従って、DAKOのキットを用いた細胞遠心分離によりSuperfrost Plusスライド上に細胞をプレーティングした後、免疫化学が使用されます。

免疫組織化学

ホルボール 12-ミリステート 13 アセテート、25 ng/mL の存在下、10% ウシ胎児血清の RPMI-1640 中の 24 ウェル プレートでリンパ球を刺激します。イオノマイシン; 1μmol;およびブレフェルジン A、10 µg/mL (Sigma-Aldrich; ミズーリ州セントルイス)。 サイトスピンは、刺激された懸濁液150 μLのサイト遠心分離を使用して作成され、-80°Cで保存されます。 約 175,000 個の細胞が各スライドでサイトスピンされ、染色するのに十分なリンパ球です。 CD8+IFN-+、CD8+IFN-+ (または CD4+IFN-+、CD4+IFN-+) の決定および測定のための二重免疫細胞化学法は、2 つのステップで実行されます。 ステップ 1 では、一次抗 CD8 (または抗 CD4) マウス抗ヒトモノクローナル抗体と二次ウサギ抗マウス IgG-FITC 抗体を使用します。 ステップ 2 では、透過処理後、一次抗 IFN または IL-4 マウス抗ヒトモノクローナル抗体 (Caltag; Burlingame, CA) と二次ウサギ抗マウス IgG-PE を使用します。 透過処理キットは、メーカー (Dako) の指示に従って使用されます。 各比率の推定では、500 個の T 細胞をカウントし、必要に応じてサイトスピン 10 回以上染色しました。

フローサイトメトリー分析

上記のように調製されたサンプルは、蛍光活性化サイトメーター（EPICS ELITE;Coultronics;Louton、UK）で分析されました。 リンパ球は、前方（0°）および側面光散乱（90°）モードで、体積と複雑さによって厳密にゲートされました。 フィコシアネート結合抗ヒト CD45 モノクローナル抗体 (DAKO; Ely, UK) を汎白血球染色として使用し、論理ゲーティングによって非白血球イベントを除外します。 1色、2色、および3色の陽性細胞のパーセンテージが測定され、抗原密度に対応する平均チャネル値および相対蛍光強度(RFI)が推定されます。 QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) は、抗体結合の定量化に使用されます。

統計分析

数値パラメータの正規性は、Kolmogorov-Smirnov 検定を使用して検定されます。 ノンパラメトリック転帰のウィルコクソン符号順位検定とパラメトリック転帰の対応のある t 検定を使用して、2 つの異なる時点 (安定状態と増悪時) でのデータを比較します。 統計ソフトウェア (SPSS バージョン 11.0; SPSS; イリノイ州シカゴ) を分析に使用します。