Ventilator-assosiert lungebetennelse (VAP) i intensivavdelingen (ICU)

INTRODUKSJON

Ventilator-assosiert lungebetennelse (VAP) refererer vanligvis til nosokomial lungebetennelse som utvikler seg 48 timer senere fra endotrakeal intubasjon og mekanisk ventilasjon. ICU-pasienter som mottar mekanisk ventilasjon har fire ganger høyere risiko for å utvikle lungebetennelse med en rate på 3 % per dag etter dag 7 i intensivavdelingen. Flere risikofaktorer er rapportert å være assosiert med VAP, inkludert varigheten av mekanisk ventilasjon, tilstedeværelsen av kronisk lungesykdom, sepsis, akutt respiratorisk distress syndrom (ARDS), nevrologisk sykdom og traumer. Immunsystemet forsvarer verten mot infeksjon. Beskyttende immunitet kan deles inn i medfødt og adaptiv immunitet. Den medfødte immunresponsen utvikler seg som en første forsvarsbarriere i verten og setter i gang en umiddelbar, men uspesifikk, immunrespons for raskt å ødelegge eller begrense inntrengerne. De medfødte forsvarsmekanismene er ytre epitel, slimhinneoverflatene, cellene (NK-celler, fagocytter) og komplementsystemet.

Adaptiv immunitet er et andrelinjeforsvar som inkluderer T (cellulær) og B (humoral) cellemediert respons. Dette er spesifikt, retter seg kun mot patogener og ikke seg selv, og har hukommelse for å opprettholde en langvarig immunitet mot reinfeksjon. Selv om det medfødte immunsystemet mangler den fine spesifisiteten til adaptiv immunitet, kan det skille seg selv fra ikke-selv. Medfødt immungjenkjenning formidles av et system av kimlinjekodede reseptorer kalt mønstergjenkjenningsreseptorer (PRRs) som gjenkjenner konserverte molekylære mønstre (patogenassosierte molekylære mønstre, PAMPs) som er assosiert med mikrobielle patogener. Disse reseptorene er koblet til signaltransduksjonsveier som kontrollerer ekspresjon av en rekke induserbare immunresponsgener.

TLR-er kontrollerer både medfødte og adaptive immunresponser. Den TLR-induserte inflammatoriske responsen er avhengig av en vanlig signalvei som formidles av adaptermolekylet MyD88. TLR-ekspresjon er observert i en rekke celler som makrofager, nøytrofiler, dendrittiske celler, epitelceller avledet fra tarm, lunge og derma, B- og T-lymfocytter. TLR4 var den første pattedyr-TLR som ble identifisert og er involvert i gjenkjennelsen av lipopolysakkarid (LPS), en viktig celleveggkomponent av gramnegative bakterier som kan indusere sepsis. TLR2 er den kraftigste reseptoren og gjenkjenner et bredt utvalg av PAMP fra bakterier, gjær, sopp, parasitter og virus. TLR9 gjenkjenner umetylerte CpG-motiver som er tilstede i bakterielt DNA.

Sepsis-syndrom kompliseres ofte av utviklingen av sykehusinfeksjoner, spesielt Gram-negativ lungebetennelse. Funn indikerer at TLR9 fungerer som et viktig signal i genereringen av beskyttende medfødte responser på bakterielle patogener i lungen og som er nødvendig for effektive medfødte immunresponser mot Gram-negative bakterielle patogener. Umetylerte CpG-motiver er utbredt i bakteriell, men ikke vertebrat genomisk DNA. Gjenkjennelsen av CpG-motiver aktiverer vertsforsvarsmekanismer som fører til medfødte og ervervede immunresponser. Celler som uttrykker TLR-9 er de plasmacytoide dendrittiske cellene (PDCs) og B-cellene og produserer som en konsekvens Th1-lignende proinflammatoriske cytokiner, interferoner og kjemokiner. Aktivering av TLR-9 induserer produksjon av a) cytokiner (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferon (IFN)-y og tumornekrosefaktor (TNF-)α som er Th1 proinflammatoriske cytokiner og b) IL-10 og IL-4 som er Th2 proinflammatoriske cytokiner som induserer immunsuppresjon.

Th1-cytokiner spiller en sentral rolle i betennelse og aktivering av makrofager, NK-celler og nøytrofiler. Th2 cytokiner hemmer Th1 immunrespons. Dette forårsaker et systemisk systemisk inflammatorisk responssyndrom. Dessuten spiller tolllignende reseptorer-2 (TLR2) og -4 (TLR4) en avgjørende rolle i kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS). Deres aktivering av LPS av Gram (-) og Gram (+) bakterier fører til aktivering av nøytrofiler, NK-celler, T-, B-celler og inflammatoriske cytokiner. Ved kronisk sykdom opprettholder dysregulert betennelse disse systemene i en tilstand av konstant aktivering, noe som potensielt kan resultere i vevsskade og progressiv sykdom. Å forstå TLR-systemet bør tilby uvurderlige muligheter for å manipulere vertens immunrespons.

MÅL

1. For å undersøke og belyse rollen til CD4+ και CD8+ Τ lymfocytter i patogenesen av VAP. Også nivået av cytokiner IL-4 og IFN-y tiden da pasientene på intensivavdelingen utvikler VAP og endringene i subpopulasjonene av Τ-lymfocytter.
2. For å evaluere apoptose av makrofager og deres evne til å fagocytere hos VAP-pasienter.
3. For å studere uttrykket og mulige polymorfismer av TLR-2, TLR-4 og TLR-9 gener.

Forståelse av immunrespons mot VAP vil tillate utarbeidelse av immunterapiprotokoller for å regulere immunologisk respons.

METODER

MATERIALER OG METODER

Bronkoalveolær lavagebehandling

Den første dagen vil det bli tatt blodprøver, bronkoalveolær lavage (BAL) og trakeobronkial aspirat (TBA) hos hver pasient. Bronkoskopi er en teknikk for å visualisere innsiden av luftveiene for diagnostiske og terapeutiske formål. Et bronkoskop settes inn i luftveiene, vanligvis gjennom nesen eller munnen, eller noen ganger gjennom en trakeostomi. Dette lar utøveren undersøke pasientens luftveier for unormaliteter som fremmedlegemer, blødninger, svulster eller betennelser. Prøver kan tas fra innsiden av lungene: biopsier, væske (bronkoalveolær skylling) eller endobronkial børsting. BAL utføres vanligvis for å diagnostisere lungesykdom. Spesielt er BAL ofte brukt til å diagnostisere infeksjoner hos personer med immunsystemproblemer, lungebetennelse hos personer på ventilatorer og enkelte typer lungekreft. BAL brukes ofte i immunologisk forskning som et middel for prøvetaking av celler eller patogennivåer i lungen (T-cellepopulasjoner). Prøver kan tas igjen innen 48 timer etter diagnosen VAP. BAL vil bli plassert i 10% FBS-RPMIc og sentrifuger ved 400g, 5 minutter, og deretter vil bli tilsatt RPMI-1640 og 10% FBS. Antallet og typen av cellene vil bli definert av Μay-Grunwald-Giemsa-farging, og underpopulasjonene med flowcytometri.

PBMC-isolasjon

Humane lymfocytter kan lettest isoleres fra perifert blod ved tetthetssentrifugering med karbohydratpolymeren Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Dette gir en populasjon av mononukleære celler ved grensesnittet som har blitt tømt for røde blodceller og de fleste polymorfonukleære leukocytter eller granulocytter. Den resulterende populasjonen, kalt mononukleære celler i perifert blod, består hovedsakelig av lymfocytter og monocytter. Fortynnet antikoagulert blod legges over Ficoll og sentrifugeres ved 400 g, 30 minutter ved 20 ºC (langsom akselerasjon, ingen brems). Røde blodlegemer, polymorfonukleære leukocytter eller granulocytter har høyere tetthet fra Ficoll og er til bunnen av røret. Men mononukleære celler som består av lymfocytter sammen med noen monocytter bånd over det og kan gjenvinnes ved grensesnittet. Celler vaskes ved å bruke 1xPBS med 1 mM EDTA 3 ganger for å fjerne Ficoll og blodplater.

Antistoffmerking

Anti-CD3-FITC (fluorescein-isotiocyanat), anti-CD8-PE (fykoerytrin), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ og anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 og kontrollerer IgG-FITC og -PE vil bli brukt til merking av celler. Fluorescein isothiocyanat (FITC), et reaktivt derivat av fluorescein, har vært en av de vanligste fluoroforene kjemisk festet til andre, ikke-fluorescerende molekyler for å lage nye fluorescerende molekyler for en rekke bruksområder. DAKO-system vil bli brukt. For farging vil immunkjemi bli brukt etter utplating av cellene på Superfrost Plus-objektglass ved cytosentrifugering med settet til DAKO i henhold til instruksjonene fra produsenten.

Immunhistokjemi

Lymfocytter vil bli stimulert i 24-brønners plater i RPMI-1640 ved 10 % føtalt kalveserum i nærvær av phorbol 12-myristat 13 acetat, 25 ng/ml; ionomycin; 1 µmol; og Brefeldin A, 10 ug/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Cytospins vil bli laget ved bruk av cytosentrifugering av 150 µL av den stimulerte suspensjonen og lagres ved -80°C. Omtrent 175 000 celler vil bli cytospunnet på hvert objektglass som er tilstrekkelig med lymfocytter til å farge. Den doble immuncytokjemiske metoden for bestemmelse og måling av CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (eller CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) vil bli utført i to trinn. I trinn én, bruk det primære anti-CD8 (eller anti-CD4, henholdsvis) muse-anti-humant monoklonalt antistoff med sekundært kanin-anti-muse-IgG-FITC-antistoff. Ved trinn to, etter permeabilisering, et primært anti-IFN- eller IL-4 muse-anti-humant monoklonalt antistoff (Caltag; Burlingame, CA) med sekundært kanin-anti-muse-IgG-PE. Et permeabiliseringssett vil bli brukt i henhold til instruksjonene fra produsenten (Dako). For estimering av hvert forhold, 500 T-celler, teller vi > 10 cytospin farget om nødvendig fordi dette tallet er tilstrekkelig til å oppnå en gjennomsnittsverdi per individ som forblir konstant etter ytterligere økning av antall talte celler.

Flowcytometrisk analyse

Prøvene fremstilt som beskrevet ovenfor ble analysert på et fluorescensaktivert cytometer (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). Lymfocyttene var tett lukket etter volum og kompleksitet på en forover (0o) og sidelysspredningsmodus (90o). Phycocyanat-konjugerte anti-humane CD45 monoklonale antistoffer (DAKO; Ely, UK) vil bli brukt som pan-leukocyttfarging for å utelukke ikke-leukocytthendelser ved logisk gating. Prosentandelen av enfargede, tofargede og trefargede positive celler vil bli målt, og den gjennomsnittlige kanalverdien samt den relative fluorescensintensiteten (RFI) som tilsvarer antigentettheten vil bli estimert. QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) vil bli brukt for kvantifisering av antistoffbinding.

Statistisk analyse

Normaliteten til de numeriske parameterne vil bli testet ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov-testen. Wilcoxon signed-rank test for ikke-parametriske utfall og paret t-test for parametriske utfall vil bli brukt for sammenligning av data på to forskjellige tidspunkter (ved stabil tilstand og ved eksacerbasjon). Statistisk programvare (SPSS versjon 11.0; SPSS; Chicago, IL) vil bli brukt til analyse.