Beatmungsassoziierte Pneumonie (VAP) auf der Intensivstation (ICU)

EINLEITUNG

Beatmungsassoziierte Pneumonie (VAP) bezieht sich typischerweise auf eine nosokomiale Pneumonie, die sich 48 Stunden später nach endotrachealer Intubation und mechanischer Beatmung entwickelt die Intensivstation. Es wurde berichtet, dass mehrere Risikofaktoren mit VAP in Verbindung stehen, darunter die Dauer der mechanischen Beatmung, das Vorhandensein einer chronischen Lungenerkrankung, Sepsis, akutes Atemnotsyndrom (ARDS), neurologische Erkrankungen und Traumata. Das Immunsystem verteidigt den Wirt gegen Infektionen. Die schützende Immunität kann in angeborene und adaptive Immunität unterteilt werden. Die angeborene Immunantwort entwickelt sich als erste Abwehrbarriere im Wirt und baut eine sofortige, aber unspezifische Immunantwort auf, um die Eindringlinge schnell zu zerstören oder einzuschränken. Die angeborenen Abwehrmechanismen sind die äußeren Epithelien, die Schleimhautoberflächen, die Zellen (NK-Zellen, Fresszellen) und das Komplementsystem.

Die adaptive Immunität ist eine zweite Verteidigungslinie, die durch T- (zelluläre) und B- (humorale) Zellen vermittelte Antworten umfasst. Dies ist spezifisch, zielt nur auf Krankheitserreger ab und nicht auf sich selbst und hat ein Gedächtnis, um eine lang anhaltende Immunität gegen eine erneute Infektion aufrechtzuerhalten. Obwohl dem angeborenen Immunsystem die feine Spezifität der adaptiven Immunität fehlt, kann es Selbst von Nicht-Selbst unterscheiden. Die Erkennung des angeborenen Immunsystems wird durch ein System keimbahnkodierter Rezeptoren vermittelt, die als Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) bezeichnet werden und konservierte molekulare Muster (Pathogen-assoziierte molekulare Muster, PAMPs) erkennen, die mit mikrobiellen Pathogenen assoziiert sind. Diese Rezeptoren sind an Signaltransduktionswege gekoppelt, die die Expression einer Vielzahl von induzierbaren Immunantwortgenen kontrollieren.

TLRs kontrollieren sowohl angeborene als auch adaptive Immunantworten. Die TLR-induzierte Entzündungsreaktion ist von einem gemeinsamen Signalweg abhängig, der durch das Adaptermolekül MyD88 vermittelt wird. Die TLR-Expression wird in einer Vielzahl von Zellen wie Makrophagen, Neutrophilen, dendritischen Zellen, Epithelzellen aus Darm, Lunge und Derma, B- und T-Lymphozyten beobachtet. TLR4 war der erste identifizierte Säuger-TLR und ist an der Erkennung von Lipopolysaccharid beteiligt (LPS), ein wichtiger Zellwandbestandteil gramnegativer Bakterien, der eine Sepsis auslösen kann. TLR2 ist der stärkste Rezeptor und erkennt eine Vielzahl von PAMPs von Bakterien, Hefen, Pilzen, Parasiten und Viren. TLR9 erkennt unmethylierte CpG-Motive, die in bakterieller DNA vorhanden sind.

Das Sepsis-Syndrom wird häufig durch die Entwicklung von nosokomialen Infektionen, insbesondere gramnegativer Pneumonie, kompliziert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass TLR9 als wichtiges Signal bei der Erzeugung von schützenden angeborenen Reaktionen auf bakterielle Pathogene der Lunge dient und dass es für wirksame angeborene Immunantworten gegen gramnegative bakterielle Pathogene erforderlich ist. Unmethylierte CpG-Motive sind in bakterieller, aber nicht in genomischer DNA von Wirbeltieren vorherrschend. Die Erkennung von CpG-Motiven aktiviert Abwehrmechanismen des Wirts, was zu angeborenen und erworbenen Immunantworten führt. Zellen, die TLR-9 exprimieren, sind die plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs) und die B-Zellen und produzieren als Folge Th1-ähnliche proinflammatorische Zytokine, Interferone und Chemokine. Die Aktivierung von TLR-9 induziert die Produktion von a) Zytokinen (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), Interferon (IFN)-γ und Tumornekrosefaktor (TNF-)α, die proinflammatorische Th1-Zytokine sind und b) IL-10 und IL-4, die proinflammatorische Th2-Zytokine sind, die eine Immunsuppression induzieren.

Th1-Zytokine spielen eine zentrale Rolle bei der Entzündung und Aktivierung von Makrophagen, NK-Zellen und Neutrophilen. Th2-Zytokine hemmen die Th1-Immunantwort. Dies verursacht ein systemisches systemisches Entzündungsreaktionssyndrom. Auch die Toll-like-Rezeptoren-2 (TLR2) und -4 (TLR4) spielen eine entscheidende Rolle bei der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD). Ihre Aktivierung durch LPS von Gram(-)- und Gram(+)-Bakterien führt zur Aktivierung von Neutrophilen, NK-Zellen, T-, B-Zellen und entzündlichen Zytokinen. Bei chronischen Erkrankungen hält eine fehlregulierte Entzündung diese Systeme in einem Zustand ständiger Aktivierung, was möglicherweise zu Gewebeschäden und fortschreitender Erkrankung führt. Das Verständnis des TLR-Systems sollte eine unschätzbare Gelegenheit zur Manipulation der Immunantworten des Wirts bieten.

ZIELE

1. Untersuchung und Aufklärung der Rolle von CD4+ και CD8+ Τ Lymphozyten bei der Pathogenese von VAP. Auch der Spiegel der Zytokine IL-4 und IFN-γ, der Zeitpunkt, zu dem die Patienten auf der Intensivstation VAP entwickeln, und die Veränderungen der Subpopulationen von Τ-Lymphozyten.
2. Bewertung der Apoptose von Makrophagen und ihrer Phagozytenkapazität bei VAP-Patienten.
3. Untersuchung der Expression und möglicher Polymorphismen der TLR-2-, TLR-4- und TLR-9-Gene.

Das Verständnis der Immunantwort auf VAP wird die Vorbereitung von Immuntherapieprotokollen ermöglichen, um die immunologische Antwort zu regulieren.

METHODEN

MATERIALEN UND METHODEN

Bronchoalveoläre Lavage-Verarbeitung

Am ersten Tag werden bei jedem Patienten Blutproben, bronchoalveoläre Lavage (BAL) und tracheobronchiale Aspirate (TBA) entnommen. Die Bronchoskopie ist eine Technik zur Darstellung des Inneren der Atemwege zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken. Ein Bronchoskop wird in die Atemwege eingeführt, normalerweise durch die Nase oder den Mund oder gelegentlich durch ein Tracheostoma. Dadurch kann der Arzt die Atemwege des Patienten auf Anomalien wie Fremdkörper, Blutungen, Tumore oder Entzündungen untersuchen. Proben können aus dem Inneren der Lunge entnommen werden: Biopsien, Flüssigkeit (bronchoalveoläre Lavage) oder endobronchiales Bürsten. BAL wird typischerweise durchgeführt, um eine Lungenerkrankung zu diagnostizieren. Insbesondere wird BAL häufig zur Diagnose von Infektionen bei Menschen mit Problemen des Immunsystems, Lungenentzündung bei Menschen mit Beatmungsgeräten und einigen Arten von Lungenkrebs eingesetzt. BAL wird häufig in der immunologischen Forschung als Mittel zur Probenahme von Zellen oder Erregerspiegeln in der Lunge (T-Zellpopulationen) verwendet. Proben können innerhalb von 48 Stunden nach der Diagnose von VAP erneut entnommen werden. BAL wird in 10 % FBS-RPMIc gegeben und bei 400 g für 5 min zentrifugiert, und dann werden RPMI-1640 und 10 % FBS hinzugefügt. Die Anzahl und Art der Zellen wird durch May-Grunwald-Giemsa-Färbung und die Subpopulationen mit Durchflusszytometrie bestimmt.

PBMC-Isolierung

Humane Lymphozyten lassen sich am einfachsten aus peripherem Blut durch Dichtezentrifugation mit dem Kohlenhydratpolymer Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Kat. 1077-1) isolieren. Dies führt zu einer Population mononuklearer Zellen an der Grenzfläche, die von roten Blutkörperchen und den meisten polymorphkernigen Leukozyten oder Granulozyten verarmt ist. Die resultierende Population, die als periphere mononukleäre Blutzellen bezeichnet wird, besteht hauptsächlich aus Lymphozyten und Monozyten. Verdünntes antikoaguliertes Blut wird über Ficoll geschichtet und bei 400 g, 30 min bei 20 °C (langsame Beschleunigung, keine Bremse) zentrifugiert. Rote Blutkörperchen, polymorphkernige Leukozyten oder Granulozyten haben eine höhere Dichte von Ficoll und befinden sich am Boden des Röhrchens. Aber mononukleäre Zellen, die aus Lymphozyten zusammen mit einigen Monozyten bestehen, binden darüber und können an der Grenzfläche gewonnen werden. Die Zellen werden unter Verwendung von 1 × PBS mit 1 mM EDTA dreimal gewaschen, um Ficoll und Blutplättchen zu entfernen.

Antikörperkennzeichnung

Anti-CD3-FITC (Fluoresceinisothiocyanat), Anti-CD8-PE (Phycoerythrin), Anti-CD4-PE, Anti-IFN-γ und Anti-IL-4, Anti-CD4, Anti-CD8 und Kontrollen IgG-FITC und -PE wird zum Markieren von Zellen verwendet. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), ein reaktives Derivat von Fluorescein, war einer der häufigsten Fluorophore, die chemisch an andere, nicht fluoreszierende Moleküle gebunden wurden, um neue fluoreszierende Moleküle für eine Vielzahl von Anwendungen zu erzeugen. Es wird das DAKO-System verwendet. Zur Färbung wird Immunchemie verwendet, nachdem die Zellen auf Superfrost Plus-Objektträgern durch Zytozentrifugation mit dem Kit von DAKO gemäß den Anweisungen des Herstellers ausplattiert wurden.

Immunhistochemie

Lymphozyten werden in Platten mit 24 Vertiefungen in RPMI-1640 mit 10 % fötalem Kälberserum in Gegenwart von Phorbol-12-Myristat-13-acetat, 25 ng/ml, stimuliert; Ionomycin; 1 umol; und Brefeldin A, 10 ug/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Cytospins werden durch Zytozentrifugation von 150 &mgr;l der stimulierten Suspension hergestellt und bei –80°C gelagert. Ungefähr 175.000 Zellen werden auf jedem Objektträger zytogesponnen, von denen genügend Lymphozyten zum Färben vorhanden sind. Die doppelte immunzytochemische Methode zur Bestimmung und Messung von CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (oder CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) wird in zwei Schritten durchgeführt. Verwenden Sie in Schritt eins den primären Anti-CD8 (bzw. Anti-CD4) Maus-Anti-Mensch-monoklonalen Antikörper mit sekundärem Kaninchen-Anti-Maus-IgG-FITC-Antikörper. In Schritt zwei, nach der Permeabilisierung, ein primärer anti-IFN- oder IL-4-Maus-anti-Mensch-monoklonaler Antikörper (Caltag; Burlingame, CA) mit sekundärem Kaninchen-anti-Maus-IgG-PE. Ein Permeabilisierungskit wird gemäß den Anweisungen des Herstellers (Dako) verwendet. Für die Schätzung jedes Verhältnisses, 500 T-Zellen, zählen wir > 10 gegebenenfalls gefärbte Cytospins, da diese Anzahl ausreicht, um einen Mittelwert pro Probanden zu erhalten, der nach weiterer Erhöhung der gezählten Zellzahl konstant bleibt.

Durchflusszytometrische Analyse

Die wie oben beschrieben hergestellten Proben wurden auf einem fluoreszenzaktivierten Zytometer (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK) analysiert. Die Lymphozyten wurden nach Volumen und Komplexität in einem Vorwärts- (0o) und seitlichen Lichtstreuungsmodus (90o) streng abgegrenzt. Phycocyanat-konjugierte monoklonale Anti-Human-CD45-Antikörper (DAKO; Ely, UK) werden als Pan-Leukozyten-Färbung verwendet, um Nicht-Leukozyten-Ereignisse durch logisches Gating auszuschließen. Der Prozentsatz einfarbiger, zweifarbiger und dreifarbiger positiver Zellen wird gemessen und der mittlere Kanalwert sowie die der Antigendichte entsprechende relative Fluoreszenzintensität (RFI) abgeschätzt. QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) wird zur Quantifizierung der Antikörperbindung verwendet.

Statistische Analyse

Die Normalität der numerischen Parameter wird mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test getestet. Der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test für nichtparametrische Ergebnisse und der gepaarte t-Test für parametrische Ergebnisse werden zum Vergleich von Daten zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (bei stabilem Zustand und bei Exazerbation) verwendet. Statistische Software (SPSS Version 11.0; SPSS; Chicago, IL) wird für die Analyse verwendet.