Légzőgéppel összefüggő tüdőgyulladás (VAP) az intenzív osztályon (ICU)

BEVEZETÉS

A lélegeztetőgéppel összefüggő tüdőgyulladás (VAP) jellemzően az endotracheális intubáció és a gépi lélegeztetés következtében 48 órával később kialakuló nozokomiális tüdőgyulladásra utal. A mechanikus lélegeztetésben részesülő intenzív osztályos betegeknél a 7. nap után napi 3%-os tüdőgyulladás kialakulásának kockázata 4-szer nagyobb. az intenzív osztályon. Számos kockázati tényező összefüggésbe hozható a VAP-val, beleértve a gépi lélegeztetés időtartamát, a krónikus tüdőbetegség, a szepszis, az akut légzési distressz szindróma (ARDS), a neurológiai betegségek és a trauma jelenlétét. Az immunrendszer megvédi a gazdát a fertőzésekkel szemben. A védő immunitás veleszületett és adaptív immunitásra osztható. A veleszületett immunválasz az első védekezési gátként fejlődik ki a gazdaszervezetben, és azonnali, de nem specifikus immunválaszt hoz létre, hogy gyorsan elpusztítsa vagy korlátozza a betolakodókat. A veleszületett védekezési mechanizmusok a külső epitélium, a nyálkahártya felületek, a sejtek (NK-sejtek, fagociták) és a komplementrendszer.

Az adaptív immunitás egy második vonalbeli védekezés, amely magában foglalja a T (celluláris) és B (humorális) sejtek által közvetített válaszokat. Ez specifikus, csak a kórokozókat célozza meg, nem pedig önmagát, és rendelkezik memóriával az újrafertőződés elleni hosszú távú immunitás fenntartásához. Bár a veleszületett immunrendszerből hiányzik az adaptív immunitás finom specifitása, meg tudja különböztetni önmagát a nem önmagától. A veleszületett immunfelismerést a csíravonal által kódolt receptorok rendszere, az úgynevezett mintázatfelismerő receptorok (PRR-ek) közvetíti, amelyek felismerik a mikrobiális kórokozókhoz kapcsolódó konzervált molekuláris mintákat (patogén-asszociált molekuláris mintázatok, PAMP-ok). Ezek a receptorok olyan jelátviteli útvonalakhoz kapcsolódnak, amelyek számos indukálható immunválasz-gén expresszióját szabályozzák.

A TLR-ek mind a veleszületett, mind az adaptív immunválaszokat szabályozzák. A TLR által kiváltott gyulladásos válasz egy közös jelátviteli útvonaltól függ, amelyet a MyD88 adaptermolekula közvetít. A TLR expressziója számos sejtben megfigyelhető, például makrofágokban, neutrofilekben, dendritikus sejtekben, bélből, tüdőből és dermából származó hámsejtekben, B- és T-limfocitákban. A TLR4 volt az első azonosított emlős TLR, és részt vesz a lipopoliszacharidok felismerésében. (LPS), a Gram-negatív baktériumok egyik fő sejtfal-komponense, amely szepszist okozhat. A TLR2 a legerősebb receptor, és a baktériumok, élesztőgombák, gombák, paraziták és vírusok PAMP-jainak széles skáláját ismeri fel. A TLR9 felismeri a bakteriális DNS-ben jelen lévő nem metilált CpG-motívumokat.

A szepszis szindrómát gyakran bonyolítja a nozokomiális fertőzések, különösen a Gram-negatív tüdőgyulladás kialakulása. Az eredmények azt mutatják, hogy a TLR9 fontos jelként szolgál a tüdő bakteriális kórokozóival szembeni védő veleszületett válaszok létrehozásában, és ez szükséges a Gram-negatív bakteriális kórokozókkal szembeni hatékony veleszületett immunválaszhoz. A nem metilált CpG motívumok elterjedtek a bakteriális, de nem a gerinces genomi DNS-ben. A CpG-motívumok felismerése aktiválja a gazdaszervezet védekező mechanizmusait, ami veleszületett és szerzett immunválaszokhoz vezet. A TLR-9-et expresszáló sejtek a plazmacitoid dendritikus sejtek (PDC) és a B-sejtek, és ennek következtében Th1-szerű proinflammatorikus citokineket, interferonokat és kemokineket termelnek. A TLR-9 aktiválása a) citokinek (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferon (IFN)-γ és tumor nekrózis faktor (TNF-)α termelését indukálja, amelyek Th1 proinflammatorikus citokinek és b) IL-10 és IL-4, amelyek Th2 proinflammatorikus citokinek, amelyek immunszuppressziót indukálnak.

A Th1 citokinek központi szerepet játszanak a gyulladásban és a makrofágok, NK-sejtek és neutrofilek aktiválásában. A Th2 citokinek gátolják a Th1 immunválaszt. Ez szisztémás szisztémás gyulladásos válasz szindrómát okoz. Ezenkívül a 2-es (TLR2) és -4-es (TLR4) útdíjszerű receptorok döntő szerepet játszanak a krónikus obstruktív tüdőbetegségben (COPD). A Gram (-) és Gram (+) baktériumok LPS általi aktiválása neutrofilek, NK-sejtek, T-, B-sejtek és gyulladásos citokinek aktiválásához vezet. Krónikus betegségekben a szabályozatlan gyulladás ezeket a rendszereket állandó aktiváció állapotában tartja, ami szövetkárosodást és progresszív betegséget eredményezhet. A TLR rendszer megértése felbecsülhetetlen lehetőséget kínál a gazdaszervezet immunválaszának manipulálására.

CÉLOK

1. A CD4+ και CD8+ Τ limfociták szerepének vizsgálata és tisztázása a VAP patogenezisében. Továbbá az IL-4 és az IFN-γ citokinek szintje, amikor az intenzív osztályon lévő betegeknél VAP alakul ki, valamint a Τ limfociták alpopulációiban bekövetkezett változások.
2. A makrofágok apoptózisának és fagocitáló képességének értékelése VAP betegekben.
3. A TLR-2, TLR-4 és TLR-9 gének expressziójának és lehetséges polimorfizmusainak tanulmányozása.

A VAP-ra adott immunválasz megértése lehetővé teszi immunterápiás protokollok elkészítését az immunológiai válasz szabályozása érdekében.

MÓD

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Bronchoalveoláris mosás feldolgozása

Az első napon minden betegtől vérmintát, bronchoalveoláris mosást (BAL) és tracheobronchiális aspirátumot (TBA) vesznek. A bronchoszkópia a légutak belsejének vizualizálására szolgáló technika diagnosztikai és terápiás célokra. A légutakba egy bronchoszkópot helyeznek be, általában az orron vagy a szájon keresztül, vagy esetenként tracheostomián keresztül. Ez lehetővé teszi a szakember számára, hogy megvizsgálja a páciens légutait rendellenességek, például idegen testek, vérzés, daganatok vagy gyulladások szempontjából. A minták a tüdő belsejéből vehetők: biopszia, folyadék (bronchoalveoláris mosás) vagy endobronchiális fogmosás. A BAL-t általában tüdőbetegség diagnosztizálására végzik. A BAL-t különösen gyakran használják fertőzések diagnosztizálására immunrendszeri problémákkal küzdőknél, tüdőgyulladást lélegeztetőgépet használóknál és bizonyos típusú tüdőrák diagnosztizálására. A BAL-t gyakran használják immunológiai kutatásokban a tüdőben (T-sejt-populációkban) lévő sejtek vagy kórokozók szintjének mintavételének eszközeként. A VAP diagnosztizálásától számított 48 órán belül ismét mintát lehet venni. A BAL-t 10% FBS-RPMIc-be helyezzük és 400 g-vel, 5 percig centrifugáljuk, majd hozzáadjuk az RPMI-1640-et és 10% FBS-t. A sejtek számát és típusát Μay-Grunwald-Giemsa festéssel, az alpopulációkat pedig áramlási citometriával határozzuk meg.

PBMC szigetelés

A humán limfociták a perifériás vérből a legkönnyebben a Ficoll szénhidrátpolimerrel (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1) végzett sűrűségű centrifugálással izolálhatók. Ez egy olyan mononukleáris sejtpopulációt eredményez a határfelületen, amelyből kimerült a vörösvértestek és a legtöbb polimorfonukleáris leukociták vagy granulociták. Az így létrejövő populáció, az úgynevezett perifériás vér mononukleáris sejtjei, főként limfocitákból és monocitákból áll. A hígított véralvadásgátló vért Ficollra rétegezzük, és 400 g-vel, 30 percig 20 °C-on centrifugáljuk (lassú gyorsulás, fékezés nélkül). A vörösvértestek, polimorfonukleáris leukociták vagy granulociták sűrűsége nagyobb a Ficoll-tól, és a cső alján vannak. A limfocitákból és néhány monocitával együtt álló mononukleáris sejtek azonban rajtuk kötődnek, és a határfelületen visszanyerhetők. A sejteket 1 mM EDTA-t tartalmazó 1xPBS-sel háromszor mossuk a Ficoll és a vérlemezkék eltávolítására.

Antitest jelölés

Anti-CD3-FITC (fluoreszcein-izotiocianát), anti-CD8-PE (fikoeritrin), anti-CD4-PE, anti-IFN-y és anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 és kontrollálja az IgG-FITC és -PE-t használnak a sejtek címkézésére. A fluoreszcein-izotiocianát (FITC), a fluoreszcein reaktív származéka az egyik leggyakoribb fluorofor, amely kémiailag kapcsolódik más, nem fluoreszcens molekulákhoz, hogy új fluoreszcens molekulákat hozzon létre különféle alkalmazásokhoz. DAKO rendszer kerül alkalmazásra. A festéshez immunkémiai módszert alkalmazunk, miután a sejteket Superfrost Plus tárgylemezekre szélesztettük citocentrifugálással a DAKO kittel a gyártó utasításai szerint.

Immunhisztokémia

A limfocitákat 24 lyukú lemezeken RPMI-1640-ben 10% magzati borjúszérum mellett 25 ng/ml forbol-12-mirisztát-13-acetát jelenlétében stimuláljuk; ionomicin; 1 umol; és Brefeldin A, 10 ug/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). A citoszpineket 150 µl stimulált szuszpenzió citocentrifugálásával készítjük, és -80 °C-on tároljuk. Körülbelül 175 000 sejtet cytospunnak le, amelyek mindegyikén elegendő limfocita van a festéshez. A CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (vagy CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) meghatározására és mérésére szolgáló kettős immuncitokémiai módszert két lépésben hajtjuk végre. Az első lépésben használja az elsődleges anti-CD8 (vagy anti-CD4) egér anti-humán monoklonális antitestet másodlagos nyúl anti-egér IgG-FITC antitesttel. A második lépésben, permeabilizálás után, elsődleges anti-IFN- vagy IL-4 egér anti-humán monoklonális antitest (Caltag; Burlingame, CA) másodlagos nyúl anti-egér IgG-PE-vel. A permeabilizáló készletet a gyártó (Dako) utasításai szerint kell használni. Az egyes arányok, 500 T-sejt becsléséhez szükség esetén > 10 festett citoszpint számolunk, mert ez a szám elegendő egy alanyonkénti átlagérték eléréséhez, amely állandó marad a megszámlált sejtek számának további növelése után.

Áramlási citometrikus elemzés

A fent leírt módon elkészített mintákat fluoreszcenciával aktivált citométeren (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK) analizáltuk. A limfociták térfogata és komplexitása szerint előre (0o) és oldalsó fényszórásos (90o) módban szorosan lehatárolták. A fikocianáttal konjugált anti-humán CD45 monoklonális antitesteket (DAKO; Ely, UK) pán-leukocita festésként fogják használni, hogy logikai kapuzással kizárják a nem leukocita eseményeket. Megmérik az egyszínű, kétszínű és háromszínű pozitív sejtek százalékos arányát, és megbecsülik az átlagos csatornaértéket, valamint az antigénsűrűségnek megfelelő relatív fluoreszcencia intenzitást (RFI). A QC-Combo Kit-et (FCSC; San Jun, Puerto Rico) használják az antitestek kötődésének mennyiségi meghatározására.

Statisztikai analízis

A numerikus paraméterek normálisságát Kolmogorov-Smirnov teszttel teszteljük. A Wilcoxon előjeles rangú tesztet a nem paraméteres eredményekhez és a páros t tesztet a paraméteres eredményekhez használják az adatok összehasonlítására két különböző időpontban (stabil állapotban és exacerbációkor). Az elemzéshez statisztikai szoftvert (SPSS 11.0 verzió; SPSS; Chicago, IL) használunk.