Respiratorowe zapalenie płuc (VAP) na oddziale intensywnej terapii (OIOM)

WPROWADZANIE

Zapalenie płuc związane z respiratorem (VAP) zwykle odnosi się do szpitalnego zapalenia płuc, które rozwija się 48 godzin później po intubacji dotchawiczej i wentylacji mechanicznej. U pacjentów na OIT, którzy otrzymują wentylację mechaniczną, występuje 4-krotnie większe ryzyko rozwoju zapalenia płuc z częstością 3% dziennie po 7 dniach w oddział intensywnej terapii. Zgłoszono kilka czynników ryzyka związanych z VAP, w tym czas trwania wentylacji mechanicznej, obecność przewlekłej choroby płuc, posocznicy, zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), choroby neurologicznej i urazu. Układ odpornościowy chroni gospodarza przed infekcją. Odporność ochronną można podzielić na wrodzoną i nabytą. Wrodzona odpowiedź immunologiczna ewoluuje jako pierwsza bariera obronna gospodarza i wywołuje natychmiastową, ale nieswoistą odpowiedź immunologiczną w celu szybkiego zniszczenia lub ograniczenia najeźdźców. Wrodzonymi mechanizmami obronnymi są nabłonek zewnętrzny, powierzchnie błony śluzowej, komórki (komórki NK, fagocyty) oraz układ dopełniacza.

Odporność nabyta jest drugą linią obrony, która obejmuje odpowiedzi, w których pośredniczą komórki T (komórkowe) i B (humoralne). Jest specyficzny, celuje tylko w patogeny, a nie w siebie, i ma pamięć, aby utrzymać długotrwałą odporność na ponowną infekcję. Chociaż wrodzonemu układowi odpornościowemu brakuje subtelnej specyficzności odporności nabytej, może odróżnić siebie od obcego. We wrodzonym rozpoznawaniu immunologicznym pośredniczy system receptorów kodowanych w linii zarodkowej, zwanych receptorami rozpoznawania wzorców (PRR), które rozpoznają konserwatywne wzorce molekularne (wzorce molekularne związane z patogenami, PAMP), które są związane z patogenami drobnoustrojowymi. Receptory te są sprzężone ze szlakami transdukcji sygnału, które kontrolują ekspresję różnych indukowalnych genów odpowiedzi immunologicznej.

TLR kontrolują zarówno wrodzoną, jak i nabytą odpowiedź immunologiczną. Odpowiedź zapalna indukowana przez TLR zależy od wspólnego szlaku sygnałowego, w którym pośredniczy cząsteczka adaptorowa MyD88. Ekspresję TLR obserwuje się w różnych komórkach, takich jak makrofagi, neutrofile, komórki dendrytyczne, komórki nabłonkowe pochodzące z jelit, płuc i skóry właściwej, limfocyty B i T. TLR4 był pierwszym zidentyfikowanym TLR ssaków i bierze udział w rozpoznawaniu lipopolisacharydu (LPS), główny składnik ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, który może wywoływać posocznicę. TLR2 jest najsilniejszym receptorem i rozpoznaje szeroką gamę PAMP z bakterii, drożdży, grzybów, pasożytów i wirusów. TLR9 rozpoznaje niemetylowane motywy CpG obecne w bakteryjnym DNA.

Zespół sepsy często komplikuje rozwój zakażeń szpitalnych, zwłaszcza Gram-ujemnego zapalenia płuc. Odkrycia wskazują, że TLR9 służy jako ważny sygnał w generowaniu ochronnych wrodzonych odpowiedzi na bakteryjne patogeny płuc i jest niezbędny do skutecznej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakteryjnym patogenom Gram-ujemnym. Niemetylowane motywy CpG są powszechne w genomowym DNA bakterii, ale nie kręgowców. Rozpoznanie motywów CpG aktywuje mechanizmy obronne gospodarza prowadzące do wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych. Komórki wykazujące ekspresję TLR-9 to plazmacytoidalne komórki dendrytyczne (PDC) i komórki B, aw konsekwencji wytwarzają prozapalne cytokiny podobne do Th1, interferony i chemokiny. Aktywacja TLR-9 indukuje produkcję a) cytokin (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferonu (IFN)-γ i czynnika martwicy nowotworów (TNF-)α, które są cytokinami prozapalnymi Th1 oraz b) IL-10 i IL-4, które są prozapalnymi cytokinami Th2, które indukują immunosupresję.

Cytokiny Th1 odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych i aktywacji makrofagów, komórek NK i neutrofili. Cytokiny Th2 hamują odpowiedź immunologiczną Th1. Powoduje to ogólnoustrojowy zespół ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej. Również receptory toll-podobne-2 (TLR2) i -4 (TLR4) odgrywają kluczową rolę w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP). Ich aktywacja przez LPS bakterii Gram (-) i Gram (+) prowadzi do aktywacji neutrofili, komórek NK, T-, B- i cytokin zapalnych. W chorobach przewlekłych rozregulowany stan zapalny utrzymuje te układy w stanie ciągłej aktywacji, co może prowadzić do uszkodzenia tkanek i postępującej choroby. Zrozumienie systemu TLR powinno dać nieocenioną możliwość manipulowania odpowiedziami immunologicznymi gospodarza.

CELUJE

1. Zbadanie i wyjaśnienie roli limfocytów CD4+ και CD8+ Τ w patogenezie VAP. Również poziom cytokin IL-4 i IFN-γ czas, w którym pacjenci na OIT rozwijają VAP oraz zmiany w subpopulacjach limfocytów Τ.
2. Ocena apoptozy makrofagów i ich zdolności do fagocytowania u pacjentów z VAP.
3. Badanie ekspresji i możliwych polimorfizmów genów TLR-2, TLR-4 i TLR-9.

Zrozumienie odpowiedzi immunologicznej na VAP pozwoli na przygotowanie protokołów immunoterapii regulujących odpowiedź immunologiczną.

METODY

MATERIAŁY I METODY

Przetwarzanie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego

W pierwszej dobie od każdego pacjenta zostanie pobrana próbka krwi, popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) oraz aspirat tchawiczo-oskrzelowy (TBA). Bronchoskopia jest techniką wizualizacji wnętrza dróg oddechowych w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Bronchoskop wprowadza się do dróg oddechowych, zwykle przez nos lub usta, a czasami przez tracheostomię. Pozwala to lekarzowi zbadać drogi oddechowe pacjenta pod kątem nieprawidłowości, takich jak ciała obce, krwawienia, guzy lub stany zapalne. Próbki można pobrać z wnętrza płuc: biopsje, płyn (płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe) lub szczotkowanie wewnątrzoskrzelowe. BAL jest zwykle wykonywany w celu zdiagnozowania choroby płuc. W szczególności BAL jest powszechnie stosowany do diagnozowania infekcji u osób z problemami układu odpornościowego, zapalenia płuc u osób podłączonych do respiratorów i niektórych rodzajów raka płuc. BAL jest często używany w badaniach immunologicznych jako sposób pobierania próbek komórek lub poziomów patogenów w płucach (populacje komórek T). Próbki można pobrać ponownie w ciągu 48 godzin od rozpoznania VAP. BAL zostanie umieszczony w 10% FBS-RPMIc i odwirowany przy 400 g, 5 min, a następnie zostanie dodany RPMI-1640 i 10% FBS. Liczba i rodzaj komórek zostaną określone przez barwienie Μay-Grunwald-Giemsa, a subpopulacje za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja PBMC

Ludzkie limfocyty można najłatwiej wyizolować z krwi obwodowej przez wirowanie w gęstości z polimerem węglowodanowym Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Daje to populację komórek jednojądrzastych na styku, która została pozbawiona czerwonych krwinek i większości leukocytów lub granulocytów wielojądrzastych. Powstała populacja, zwana komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej, składa się głównie z limfocytów i monocytów. Rozcieńczoną antykoagulowaną krew nakłada się na Ficoll i wiruje przy 400 g, 30 min w 20°C (wolne przyspieszenie, bez hamulca). Czerwone krwinki, leukocyty polimorfojądrowe lub granulocyty mają większą gęstość niż Ficoll i znajdują się na dnie probówki. Ale komórki jednojądrzaste składające się z limfocytów wraz z kilkoma monocytami otaczają je i można je odzyskać na styku. Komórki przemywa się stosując 1xPBS z 1 mM EDTA 3 razy w celu usunięcia Ficoll i płytek krwi.

Znakowanie przeciwciał

Anty-CD3-FITC (izotiocyjanian fluoresceiny), anty-CD8-PE (fikoerytryna), anty-CD4-PE, anty-IFN-γ i anty-IL-4, anty-CD4, anty-CD8 i kontrole IgG-FITC i -PE będzie używany do znakowania komórek. Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), reaktywna pochodna fluoresceiny, jest jednym z najpowszechniejszych fluoroforów przyłączanych chemicznie do innych, niefluorescencyjnych cząsteczek w celu tworzenia nowych cząsteczek fluorescencyjnych do różnych zastosowań. Zastosowany zostanie system DAKO. Do barwienia wykorzystana zostanie immunochemia po wysianiu komórek na szkiełka Superfrost Plus przez cytowirowanie z zestawem DAKO zgodnie z instrukcjami producenta.

Immunohistochemia

Limfocyty będą stymulowane w 24-studzienkowych płytkach w RPMI-1640 przy 10% płodowej surowicy cielęcej w obecności octanu 12-mirystynianu 13 forbolu, 25 ng/ml; jonomycyna; 1 umol; i Brefeldin A, 10 ug/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Cytospiny zostaną wykonane przy użyciu cytowirowania 150 µl stymulowanej zawiesiny i będą przechowywane w temperaturze -80°C. Około 175 000 komórek zostanie cytowirowanych na każdym szkiełku, z których liczba limfocytów jest wystarczająca do wybarwienia. Podwójna immunocytochemiczna metoda oznaczenia i pomiaru CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (lub CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) zostanie przeprowadzona w dwóch etapach. W kroku pierwszym należy użyć pierwszorzędowego mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-CD8 (lub odpowiednio anty-CD4) z drugorzędowym króliczym przeciwciałem anty-mysim IgG-FITC. W etapie drugim, po permeabilizacji, pierwszorzędowe mysie anty-ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-IFN- lub IL-4 (Caltag; Burlingame, CA) z drugorzędowym króliczym anty-mysim IgG-PE. Zestaw do przepuszczania zostanie użyty zgodnie z instrukcjami producenta (Dako). W celu oszacowania każdego stosunku, liczymy 500 limfocytów T > 10 cytospinów barwionych w razie potrzeby, ponieważ ta liczba jest wystarczająca do uzyskania średniej wartości na osobnika, która pozostaje stała po dalszym zwiększeniu liczby zliczonych komórek.

Analiza metodą cytometrii przepływowej

Próbki przygotowane w sposób opisany powyżej analizowano na cytometrze aktywowanym fluorescencją (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, Wielka Brytania). Limfocyty były szczelnie bramkowane pod względem objętości i złożoności w trybie rozpraszania światła do przodu (0°) i bocznego (90°). Przeciwciała monoklonalne przeciw ludzkiemu CD45 skoniugowane z fikocyjanianem (DAKO; Ely, Wielka Brytania) zostaną użyte jako barwienie wszystkich leukocytów w celu wykluczenia zdarzeń innych niż leukocyty przez bramkowanie logiczne. Zmierzony zostanie odsetek jednokolorowych, dwukolorowych i trójkolorowych komórek dodatnich i zostanie oszacowana średnia wartość kanału, jak również względna intensywność fluorescencji (RFI) odpowiadająca gęstości antygenu. QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) zostanie użyty do ilościowego określenia wiązania przeciwciała.

Analiza statystyczna

Normalność parametrów numerycznych zostanie zbadana za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa. Do porównania danych w dwóch różnych punktach czasowych (w stanie stabilnym i podczas zaostrzenia) zostanie wykorzystany test rangowanych Wilcoxona dla wyników nieparametrycznych i sparowany test t dla wyników parametrycznych. Do analizy zostanie użyte oprogramowanie statystyczne (SPSS wersja 11.0; SPSS; Chicago, IL).