Ventilator-associeret lungebetændelse (VAP) i intensiv afdeling (ICU)

INTRODUKTION

Ventilator-associeret lungebetændelse (VAP) refererer typisk til nosokomial lungebetændelse, der udvikler sig 48 timer senere fra endotracheal intubation og mekanisk ventilation. ICU-patienter, der modtager mekanisk ventilation, har 4 gange højere risiko for at udvikle lungebetændelse med en frekvens på 3 % pr. dag efter dag 7 i intensivafdelingen. Adskillige risikofaktorer er blevet rapporteret at være forbundet med VAP, herunder varigheden af ​​mekanisk ventilation, tilstedeværelsen af ​​kronisk lungesygdom, sepsis, akut respiratorisk distress syndrom (ARDS), neurologisk sygdom og traumer. Immunsystemet forsvarer værten mod infektion. Beskyttende immunitet kan opdeles i medfødt og adaptiv immunitet. Den medfødte immunreaktion udvikler sig som en første forsvarsbarriere i værten og sætter en øjeblikkelig, men uspecifik, immunreaktion i gang for hurtigt at ødelægge eller begrænse angriberne. De medfødte forsvarsmekanismer er de ydre epitel, slimhindernes overflader, cellerne (NK-celler, fagocytter) og komplementsystemet.

Adaptiv immunitet er et andenlinjeforsvar, der inkluderer T (cellulære) og B (humorale) cellemedierede responser. Dette er specifikt, retter sig kun mod patogener og ikke sig selv og har hukommelse til at opretholde en langvarig immunitet mod geninfektion. Selvom det medfødte immunsystem mangler den fine specificitet af adaptiv immunitet, kan det skelne selv fra ikke-selv. Medfødt immungenkendelse medieres af et system af kimlinje-kodede receptorer kaldet mønstergenkendelsesreceptorer (PRR'er), der genkender konserverede molekylære mønstre (patogen-associerede molekylære mønstre, PAMP'er), der er forbundet med mikrobielle patogener. Disse receptorer er koblet til signaltransduktionsveje, der kontrollerer ekspression af en række inducerbare immunresponsgener.

TLR'er kontrollerer både medfødte og adaptive immunresponser. Den TLR-inducerede inflammatoriske respons er afhængig af en fælles signalvej, der medieres af adaptermolekylet MyD88. TLR-ekspression observeres i en række forskellige celler, såsom makrofager, neutrofiler, dendritiske celler, epitelceller afledt af tarm, lunge og derma, B- og T-lymfocytter. TLR4 var det første pattedyr-TLR, der blev identificeret og er involveret i genkendelsen af ​​lipopolysaccharid (LPS), en vigtig cellevægskomponent af gramnegative bakterier, som kan inducere sepsis. TLR2 er den mest kraftfulde receptor og genkender en lang række PAMP'er fra bakterier, gær, svampe, parasitter og vira. TLR9 genkender ikke-methylerede CpG-motiver til stede i bakterielt DNA.

Sepsis-syndrom kompliceres ofte af udviklingen af ​​nosokomiale infektioner, især gramnegativ lungebetændelse. Resultater indikerer, at TLR9 tjener som et vigtigt signal i genereringen af ​​beskyttende medfødte reaktioner på bakterielle patogener i lungen, og det er påkrævet for effektive medfødte immunresponser mod gramnegative bakterielle patogener. Umethylerede CpG-motiver er fremherskende i bakterielt, men ikke vertebrat genomisk DNA. Genkendelsen af ​​CpG-motiver aktiverer værtsforsvarsmekanismer, der fører til medfødte og erhvervede immunresponser. Celler, der udtrykker TLR-9, er de plasmacytoide dendritiske celler (PDC'er) og B-cellerne og producerer som en konsekvens Th1-lignende proinflammatoriske cytokiner, interferoner og kemokiner. Aktivering af TLR-9 inducerer produktionen af ​​a) cytokiner (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferon (IFN)-y og tumornekrosefaktor (TNF-)α, som er Th1 proinflammatoriske cytokiner og b) IL-10 og IL-4, som er Th2-proinflammatoriske cytokiner, der inducerer immunsuppression.

Th1-cytokiner spiller en central rolle i inflammation og aktivering af makrofager, NK-celler og neutrofiler. Th2 cytokiner hæmmer Th1 immunrespons. Dette forårsager et systemisk systemisk inflammatorisk respons syndrom. Også toll-lignende receptorer-2 (TLR2) og -4 (TLR4) spiller en afgørende rolle i kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). Deres aktivering med LPS af Gram (-) og Gram (+) bakterier fører til aktivering af neutrofiler, NK-celler, T-, B-celler og inflammatoriske cytokiner. Ved kronisk sygdom holder dysreguleret inflammation disse systemer i en tilstand af konstant aktivering, hvilket potentielt kan resultere i vævsskade og progressiv sygdom. Forståelse af TLR-systemet bør give uvurderlige muligheder for at manipulere værtens immunresponser.

MÅL

1. At undersøge og belyse rollen af ​​CD4+ και CD8+ Τ lymfocytter i patogenesen af ​​VAP. Også niveauet af cytokiner IL-4 og IFN-y det tidspunkt, hvor patienterne på ICU udvikler VAP og ændringerne i subpopulationerne af Τ-lymfocytter.
2. At evaluere apoptose af makrofager og deres evne til at fagocytere i VAP-patienter.
3. At studere ekspressionen og mulige polymorfismer af TLR-2, TLR-4 og TLR-9 gener.

Forståelse af immunrespons på VAP vil tillade fremstilling af immunterapiprotokoller for at regulere immunologisk respons.

METODER

MATERIALER OG METODER

Bronchoalveolær lavagebehandling

På den første dag vil der blive taget prøver af blod, bronkoalveolær lavage (BAL) og tracheobronchial aspirat (TBA) hos hver patient. Bronkoskopi er en teknik til at visualisere indersiden af ​​luftvejene til diagnostiske og terapeutiske formål. Et bronkoskop indsættes i luftvejene, normalt gennem næsen eller munden, eller lejlighedsvis gennem en trakeostomi. Dette gør det muligt for lægen at undersøge patientens luftveje for abnormiteter såsom fremmedlegemer, blødninger, tumorer eller betændelse. Prøver kan tages inde fra lungerne: biopsier, væske (bronkoalveolær lavage) eller endobronchial børstning. BAL udføres typisk for at diagnosticere lungesygdom. Især er BAL almindeligvis brugt til at diagnosticere infektioner hos mennesker med immunsystemproblemer, lungebetændelse hos personer i ventilatorer og nogle typer lungekræft. BAL bruges ofte i immunologisk forskning som et middel til at tage prøver af celler eller patogenniveauer i lungen (T-cellepopulationer). Prøver kan tages igen inden for 48 timer efter diagnosen VAP. BAL placeres i 10% FBS-RPMIc og centrifugeres ved 400g, 5 minutter, og derefter tilsættes RPMI-1640 og 10% FBS. Antallet og typen af ​​celler vil blive defineret ved Μay-Grunwald-Giemsa-farvning og subpopulationerne med flowcytometri.

PBMC isolation

Humane lymfocytter kan lettest isoleres fra perifert blod ved densitetscentrifugering med kulhydratpolymeren Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Dette giver en population af mononukleære celler ved grænsefladen, som er blevet udtømt for røde blodlegemer og de fleste polymorfonukleære leukocytter eller granulocytter. Den resulterende population, kaldet mononukleære celler fra perifert blod, består hovedsageligt af lymfocytter og monocytter. Fortyndet antikoaguleret blod lægges over Ficoll og centrifugeres ved 400 g, 30 minutter ved 20ºC (langsom acceleration, ingen bremse). Røde blodlegemer, polymorfonukleære leukocytter eller granulocytter har højere tæthed fra Ficoll og er i bunden af ​​røret. Men mononukleære celler bestående af lymfocytter sammen med nogle monocytter bånd over det og kan genvindes ved grænsefladen. Celler vaskes under anvendelse af 1xPBS med 1 mM EDTA 3 gange for at fjerne Ficoll og blodplader.

Antistofmærkning

Anti-CD3-FITC (fluorescein isothiocyanat), anti-CD8-PE (phycoerythrin), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ og anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 og kontrollerer IgG-FITC og -PE vil blive brugt til mærkning af celler. Fluorescein isothiocyanat (FITC), et reaktivt derivat af fluorescein, har været en af ​​de mest almindelige fluoroforer kemisk bundet til andre, ikke-fluorescerende molekyler for at skabe nye fluorescerende molekyler til en række forskellige anvendelser. DAKO system vil blive brugt. Til farvning vil immunkemi blive brugt efter udpladning af cellerne på Superfrost Plus objektglas ved cytocentrifugering med sættet af DAKO i henhold til instruktionerne fra producenten.

Immunhistokemi

Lymfocytter vil blive stimuleret i plader med 24 brønde i RPMI-1640 ved 10 % føtalt kalveserum i nærværelse af phorbol 12-myristat 13 acetat, 25 ng/ml; ionomycin; 1 µmol; og Brefeldin A, 10 µg/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Cytospins vil blive fremstillet ved hjælp af cytocentrifugering af 150 µL af den stimulerede suspension og opbevares ved -80°C. Ca. 175.000 celler vil blive cytospundet på hvert objektglas, hvoraf der er tilstrækkelige lymfocytter til at farve. Den dobbelte immunocytokemiske metode til bestemmelse og måling af CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (eller CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) udføres i to trin. I trin et skal du bruge det primære anti-CD8 (eller anti-CD4, henholdsvis) muse anti-humant monoklonalt antistof med sekundært kanin anti-muse IgG-FITC antistof. Ved trin to, efter permeabilisering, et primært anti-IFN- eller IL-4 muse-anti-humant monoklonalt antistof (Caltag; Burlingame, CA) med sekundært kanin-anti-muse-IgG-PE. Et permeabiliseringskit vil blive brugt i henhold til producentens (Dako) instruktioner. Til estimering af hvert forhold, 500 T-celler tæller vi > 10 cytospin farvede om nødvendigt, fordi dette antal er tilstrækkeligt til at opnå en middelværdi pr. individ, der forbliver konstant efter yderligere at øge antallet af talte celler.

Flowcytometrisk analyse

Prøverne fremstillet som beskrevet ovenfor blev analyseret på et fluorescensaktiveret cytometer (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). Lymfocytterne var tæt lukket efter volumen og kompleksitet på en fremadgående (0o) og sidelysspredningstilstand (90o). Phycocyanat-konjugerede anti-humane CD45 monoklonale antistoffer (DAKO; Ely, UK) vil blive brugt som pan-leukocytfarvning for at udelukke ikke-leukocythændelser ved logisk gating. Procentdelen af ​​enfarvede, tofarvede og trefarvede positive celler vil blive målt, og den gennemsnitlige kanalværdi såvel som den relative fluorescensintensitet (RFI) svarende til antigendensiteten vil blive estimeret. QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) vil blive brugt til kvantificering af antistofbinding.

Statistisk analyse

Normaliteten af ​​de numeriske parametre vil blive testet ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov-testen. Wilcoxon signed-rank test for ikke-parametriske resultater og parret t-test for parametriske resultater vil blive brugt til sammenligning af data på to forskellige tidspunkter (ved stabil tilstand og ved eksacerbation). Statistisk software (SPSS version 11.0; SPSS; Chicago, IL) vil blive brugt til analyse.