重症监护病房 (ICU) 中的呼吸机相关性肺炎 (VAP)

介绍

呼吸机相关性肺炎 (VAP) 通常是指气管插管和机械通气 48 小时后发生的院内肺炎。接受机械通气的 ICU 患者发生肺炎的风险高 4 倍，第 7 天后每天发生率为 3%重症监护病房 据报道，一些风险因素与 VAP 相关，包括机械通气的持续时间、慢性肺病、败血症、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)、神经系统疾病和外伤。 免疫系统保护宿主免受感染。 保护性免疫可分为固有免疫和适应性免疫。 先天免疫反应演化为宿主的第一道防御屏障，并产生即时但非特异性的免疫反应，以迅速摧毁或限制入侵者。 先天防御机制是外部上皮细胞、粘膜表面、细胞（NK 细胞、吞噬细胞）和补体系统。

适应性免疫是第二道防线，包括 T（细胞）和 B（体液）细胞介导的反应。 这是特定的，仅针对病原体而非自身，并且具有记忆以维持针对再感染的持久免疫力。 虽然先天免疫系统缺乏适应性免疫的良好特异性，但它可以区分自我和非自我。 先天免疫识别由称为模式识别受体 (PRR) 的种系编码受体系统介导，该系统识别与微生物病原体相关的保守分子模式（病原体相关分子模式，PAMP）。 这些受体与控制各种可诱导免疫反应基因表达的信号转导通路相结合。

TLR 控制先天性和适应性免疫反应。 TLR 诱导的炎症反应依赖于由衔接分子 MyD88 介导的共同信号通路。 在巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肠道、肺和真皮来源的上皮细胞、B 和 T 淋巴细胞等多种细胞中观察到 TLR 表达。TLR4 是第一个被鉴定的哺乳动物 TLR，参与脂多糖的识别(LPS)，革兰氏阴性菌的主要细胞壁成分，可诱发败血症。 TLR2 是最强大的受体，可识别来自细菌、酵母、真菌、寄生虫和病毒的多种 PAMP。 TLR9 识别细菌 DNA 中存在的未甲基化 CpG 基序。

脓毒症综合征经常因院内感染的发展而复杂化，尤其是革兰氏阴性肺炎。 研究结果表明，TLR9 在对肺部细菌性病原体产生保护性先天性反应中起着重要的作用，并且是针对革兰氏阴性细菌性病原体的有效先天性免疫反应所必需的。 未甲基化的 CpG 基序在细菌而非脊椎动物基因组 DNA 中普遍存在。 CpG 基序的识别激活宿主防御机制，导致先天性和获得性免疫反应。 表达 TLR-9 的细胞是浆细胞样树突状细胞 (PDC) 和 B 细胞，因此会产生 Th1 样促炎细胞因子、干扰素和趋化因子。 TLR-9 的激活诱导 a) 细胞因子（IL-12、IL-1、IL-6、IL-8）、干扰素 (IFN)-γ 和肿瘤坏死因子 (TNF-)α 的产生，它们是 Th1 促炎细胞因子b) IL-10 和 IL-4，它们是诱导免疫抑制的 Th2 促炎细胞因子。

Th1 细胞因子在巨噬细胞、NK 细胞和嗜中性粒细胞的炎症和活化中发挥重要作用。 Th2 细胞因子抑制 Th1 免疫反应。 这会导致全身性炎症反应综合征。 此外，toll​​ 样受体 2 (TLR2) 和 -4 (TLR4) 在慢性阻塞性肺病 (COPD) 中起着至关重要的作用。 它们被革兰氏 (-) 和革兰氏 (+) 细菌的 LPS 激活导致嗜中性粒细胞、NK 细胞、T-、B- 细胞和炎性细胞因子的激活。 在慢性疾病中，失调的炎症使这些系统处于持续激活状态，可能导致组织损伤和进行性疾病。 了解 TLR 系统应该为操纵宿主免疫反应提供宝贵的机会。

目标

1. 调查和阐明 CD4+ και CD8+ Τ 淋巴细胞在 VAP 发病机制中的作用。 细胞因子IL-4和IFN-γ水平与ICU患者发生VAP时间及T淋巴细胞亚群变化有关。
2. 评估VAP患者巨噬细胞凋亡及其吞噬能力。
3. 研究TLR-2、TLR-4和TLR-9基因的表达及可能的多态性。

了解对 VAP 的免疫反应将允许制定免疫治疗方案以调节免疫反应。

方法

材料和方法

支气管肺泡灌洗处理

在第一天，将采集每位患者的血液样本、支气管肺泡灌洗液 (BAL) 和气管支气管抽吸液 (TBA)。 支气管镜检查是一种可视化气道内部以用于诊断和治疗目的的技术。 支气管镜插入气道，通常通过鼻子或嘴巴，或偶尔通过气管切开术。 这允许从业者检查患者的气道是否存在异物、出血、肿瘤或炎症等异常情况。 标本可取自肺内部：活组织检查、液体（支气管肺泡灌洗）或支气管内刷洗。 BAL 通常用于诊断肺部疾病。 特别是，BAL 通常用于诊断有免疫系统问题的人的感染、使用呼吸机的人的肺炎和某些类型的肺癌。 BAL 通常用于免疫学研究，作为对肺部（T 细胞群）细胞或病原体水平进行取样的一种手段。 标本可在 VAP 诊断后 48 小时内再次采集。 BAL置于10%FBS-RPMIc中，400g离心5分钟，加入RPMI-1640和10%FBS。 细胞的数量和类型将通过 May-Grunwald-Giemsa 染色来定义，而亚群则通过流式细胞术来定义。

PBMC分离

通过使用碳水化合物聚合物 Ficoll（Ficoll Histopaque，Sigma，Cat 1077-1）进行密度离心，可以最容易地从外周血中分离人淋巴细胞。 这在已经耗尽红细胞和大多数多形核白细胞或粒细胞的界面处产生单核细胞群。 由此产生的细胞群称为外周血单核细胞，主要由淋巴细胞和单核细胞组成。 稀释的抗凝血液在 Ficoll 上分层，并在 20ºC 下以 400g 离心 30 分钟（缓慢加速，无制动）。 红细胞、多形核白细胞或粒细胞从 Ficoll 中密度较高，并位于试管底部。 但是由淋巴细胞和一些单核细胞组成的单核细胞在其上结合并可以在界面处回收。 使用含 1mM EDTA 的 1xPBS 洗涤细胞 3 次以去除 Ficoll 和血小板。

抗体标记

抗 CD3-FITC（异硫氰酸荧光素）、抗 CD8-PE（藻红蛋白）、抗 CD4-PE、抗 IFN-γ 和抗 IL-4、抗 CD4、抗 CD8 和对照 IgG-FITC 和-PE 将用于标记细胞。 异硫氰酸荧光素 (FITC) 是荧光素的一种活性衍生物，一直是最常见的荧光团之一，它通过化学方式连接到其他非荧光分子上，从而为各种应用创造新的荧光分子。 将使用DAKO系统。 对于染色，根据制造商的说明，使用 DAKO 的试剂盒通过细胞离心将细胞接种在 Superfrost Plus 载玻片上后使用免疫化学。

免疫组织化学

在 25 ng/mL 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13 乙酸盐存在下，淋巴细胞将在 RPMI-1640 中以 10% 胎牛血清在 24 孔板中受到刺激；离子霉素; 1 微摩尔；和 Brefeldin A，10 µg/mL（Sigma-Aldrich；圣路易斯，密苏里州）。 将使用 150 µL 受刺激悬浮液的细胞离心法制备细胞离心涂片，并在 - 80°C 下储存。 大约 175,000 个细胞将在每张载玻片上进行细胞纺丝，其中有足够的淋巴细胞进行染色。 CD8+IFN-+、CD8+IFN-+（或CD4+IFN-+、CD4+IFN-+）的双免疫细胞化学法测定和测定分两步进行。 在第一步中，使用初级抗 CD8（或抗 CD4）小鼠抗人单克隆抗体和二级兔抗小鼠 IgG-FITC 抗体。 在第二步，透化作用后，初级抗 IFN- 或 IL-4 小鼠抗人单克隆抗体（Caltag；Burlingame，CA）与次级兔抗小鼠 IgG-PE。 根据制造商 (Dako) 的说明使用透化试剂盒。 对于每个比率的估计，我们计数 500 个 T 细胞 > 10 个细胞离心涂片，如有必要，因为这个数字足以获得每个受试者的平均值，该平均值在进一步增加计数的细胞数量后保持不变。

流式细胞术分析

如上所述制备的样品在荧光激活细胞仪（EPICS ELITE；Coultronics；Louton，UK）上进行分析。 淋巴细胞在前向 (0o) 和侧向光散射 (90o) 模式下根据体积和复杂性进行严格门控。 藻氰酸盐缀合的抗人 CD45 单克隆抗体（DAKO；Ely，UK）将用作泛白细胞染色剂，以通过逻辑门控排除非白细胞事件。 将测量单色、双色和三色阳性细胞的百分比，并估计平均通道值以及对应于抗原密度的相对荧光强度 (RFI)。 QC-Combo 试剂盒（FCSC；San Jun，波多黎各）将用于抗体结合的定量。

统计分析

数值参数的正态性将使用 Kolmogorov-Smirnov 测试进行测试。 非参数结果的 Wilcoxon 符号秩检验和参数结果的配对 t 检验将用于比较两个不同时间点（稳定状态和恶化状态）的数据。 统计软件（SPSS 11.0 版；SPSS；伊利诺伊州芝加哥）将用于分析。